本发明涉及一种产木聚糖酶的重组菌及其应用，属于酶工程领域。

木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，是一种丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是一类可以将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的酶的总称。由于木聚糖主链的聚合度不同，支链上残基在主链上的结合位点也不同，化学性质比较复杂，所以多种酶协同作用才能完全降解木聚糖。

木聚糖酶在自然界中来源十分广泛，陆地和海洋的细菌、真菌和酵母、原生动物、甲壳动物中都存在木聚糖酶。微生物中厌氧菌、需氧菌、嗜温微生物、嗜热微生物和极端微生物都可产生木聚糖酶。目前研究和应用得最多的木聚糖酶主要来自曲霉、木霉和细菌，而商品酶应用最多的是丝状真菌来源的木聚糖酶。

木聚糖酶应用非常广泛，目前已经在食品、饲料、造纸、纺织等工业中成功应用，许多来源于木霉、曲霉以及芽孢杆菌等的木聚糖酶被商业化生产，但适用于不同需求，具有优良性质的木聚糖酶仍在不断开发之中。

Clostridium clariflavum是一种嗜热厌氧木质纤维素降解菌，对木质纤维素的降解率非常高，可降解42～59％的无预处理仅经高压灭菌的植物材料柳枝稷，而同属的C.thermocellum仅能降解33％的柳枝稷，但是对来源于Clostridium clariflavum的木聚糖酶的具体性质及相关应用鲜有报道。

本发明的第一个目的在于提供一种产木聚糖酶的重组菌，所述重组菌是以pET28a(+)为载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，表达如SEQ ID NO.1所示基因。

本发明的第二个目的在于提供构建木聚糖酶重组菌的方法，所述方法包括如下步骤：PCR扩增SEQ ID NO.1所示基因，与pET28a(+)连接并转化到E.coli BL21(DE3)，获得重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种诱导表达木聚糖酶的方法，所述方法是将所述重组大肠杆菌接种到培养基中，当OD₆₀₀为1.0～1.9时加入IPTG诱导木聚糖酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导温度为20～30℃。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导时间为4～12h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.1～0.9mmol·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是以2～5％接种量进行接种。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基配方为氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH 7。

本发明的第四个目的是提供所述的重组菌在生产木聚糖酶中的应用。

有益效果：本发明成功地实现了Clostridium clariflavum来源的木聚糖酶的异源表达，并通过IPTG诱导的方法提高了木聚糖酶的表达量，使木聚糖酶的酶活是未诱导的73倍。此外，本发明提供的木聚糖酶具有良好的pH稳定性，在pH3.5-9.5酶活性保持在80％以上，并可将木聚糖降解为木糖。

图1为本发明的木聚糖酶的pH稳定性；

图2为诱导前后木聚糖酶酶活；

图3为本发明的HPLC检测木聚糖酶降解木聚糖的产物，峰7为木糖。

酶液制备：将发酵液离心，上清液用于胞外酶活测定；沉淀用20mmol·L^-1的pH 6.0磷酸钠缓冲液重悬细胞，超声波破碎10min，功率为390W，工作3s，间歇5s，破碎以后离心，上清液即为胞内酶液。

酶活测定方法：采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)，取500uL稀释后的酶液、500uL木聚糖底物于比色管中混匀(每种样品平行做3个样)，在65℃水浴中保温10min，加入1mL DNS显色剂，沸水浴反应5min。取出，迅速冷却，用水定容至10mL，混匀，使用分光光度计，在波长540nm处测量吸光度，使测得的吸光值在0.2-0.5之间。根据标准曲线计算木聚糖酶酶活。酶活定义为每分钟降解木聚糖底物生成1μmol木糖所需的酶量为1U。

蛋白浓度的测定：Super-Bradford蛋白定量试剂盒与稀释好的蛋白质反应，用酶标仪测定595nm处的吸光值，根据蛋白标曲计算蛋白浓度。比酶活(U·mg^-1)＝酶活(U·mL^-1)×[蛋白浓度(mg·mL^-1)]^-1。

在pH 6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，45～85℃范围内，每隔5℃，测定木聚糖酶酶活，确定最适反应温度为65℃。在最适反应温度条件下，pH 5～7.5范围内，每隔0.5，测定酶活，确定最佳反应pH为6～6.5。

温度稳定性：将酶液在pH为6.5时分别在50、55、60、65、70℃中处理不同时间，冷却后在最佳反应温度下测定剩余酶活，以未处理的酶活为100％。

pH稳定性：将酶液浓缩后以相同的稀释倍数分别稀释到pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，4℃放置5h，然后在最佳反应条件下测定剩余酶活，以未处理的酶活为100％。

结果显示，木聚糖酶在pH3.5-9.5酶活性保持在80％以上，具有良好的pH稳定性。

BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时分别添加诱导剂IPTG0.4mmol·L^-1，于20℃诱导9h，测定细胞内外酶活变化情况，并以未诱导的重组菌为对照。结果显示，诱导后的重组菌胞内酶活为1.46U·mL^-1，比酶活为2.84U·mg^-1，胞外酶活为0.04U·mL^-1。不添加诱导剂IPTG时重组菌具有微量木聚糖酶酶活，胞内酶活0.02U·mL^-1，胞外酶活0.01U·mL^-1；添加诱导剂IPTG后重组菌木聚糖酶胞内酶活是未诱导的73倍(图2)。

取1mL的1％(w·v^-1)山毛榉木聚糖(溶解于20mmol·L^-1磷酸钠缓冲液)分别与1mL初始酶活1U或10U的重组木聚糖酶反应不同时间，立即煮沸灭活10min，8000r·min^-1离心10min，0.22μm滤膜过滤，采用HPLC法检测生成的木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖含量(图3)，结果显示，重组木聚糖酶可以降解山毛榉木聚糖为寡聚糖和单糖木糖，从反应开始就有较多单糖生成，且反应初始产物以木糖和木三糖为主，随着反应的进行木三糖逐渐被降解，产物最终以木糖和木二糖为主，反应3h后分别占总还原糖含量的52.7％和43.2％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

酶是一种生物催化剂，催化效率高、反应条件温和和专一性强等特点，已经日益受到人们的重视，应用也越来越广泛。生物界中已发现有多种生物酶，在生产中广泛应用的仅有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶等十几种。利用微生物生产生物酶制剂要比从植物瓜果、种子、动物组织中获得更容易。因为动、植物来源有限，且受季节、气候和地域的限制，而微生物不仅不受这些因素的影响，而且种类繁多、生长速度快、加工提纯容易、加工成本相对比较低，充分显示了微生物生产酶制剂的优越性。现在除少数几种酶仍从动、植物中提取外，绝大部分是用微生物来生产的。
酶制剂可以由细菌、酵母菌、霉菌、放线菌等微生物生产。微生物产生的各种酶以及它们在食品工业中的应用见表7-2。
表7-2微生物酶制剂及其在食品工业中的应用
耐高温a-淀粉酶糖化酶普鲁兰酶蛋白酶脂肪酶纤维素酶半纤维素酶果胶酶葡萄糖氧化酶葡萄糖异构酶菌蔗糖酶橙皮苷酶乳糖酶单宁酶花色素酶凝乳酶胺氧化酶    水解淀粉制造葡萄糖、麦芽糖、糊精水解淀粉成葡萄糖水解淀粉成直链低聚糖软化肌肉纤维、啤酒果酒澄清、动植物蛋白质水解营养液用于制作干酪和奶油，增进食品香味，大豆脱腥等用于大米、大豆、玉米脱皮，淀粉制造用于大米、大豆、玉米脱皮，提高果汁澄清度等用于柑桔脱囊衣，饮料、果酒澄清等用于蛋白质脱葡萄糖以防止食品褐变，食品除氧防腐可使葡萄糖转化为果糖制造转化糖，防止高浓度糖浆中蔗糖析出，防止糖果发沙防止柑桔罐头的白色沉淀乳糖酶缺乏的乳品制造，防止乳制品中乳糖析出食品脱涩防止水果制品变色，白葡萄酒脱去红色乳液凝固剂胺类脱臭    细菌、霉菌细菌、霉菌细菌、霉菌细菌、霉菌酵母、霉菌霉菌霉菌霉菌、细菌霉菌细菌、放线酵母霉菌酵母、霉菌霉菌霉菌霉菌酵母、细菌
    任何生物都能在一定的条件下合成某些酶。但并不是所有的细胞都能用于酶的发酵生产。一般说来，能用于酶发酵生产的细胞必须具备如下几个条件：酶的产量高。优良的产酶细胞首先具有高产的特性，才有较好的开发应用价值。高产细胞可以通过筛选、诱变、或采用基因工程、细胞工程等技术而获得；容易培养和管理，要求产酶细胞容易生长繁殖，并且适应性较强，易于控制，便于管理；产酶稳定性好。在通常的生产条件下，能够稳定地用于生产，不易退化。一旦细胞退化，要经过复壮处理，使其恢复产酶性能；利于酶的分离纯化。发酵完成后，需经分离纯化过程，才能得到所需的酶，这就要求产酶细胞本身及其它杂质易于和酶分离；安全可靠。要使用的细胞及其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，也不会对酶的应用产生其它不良的影响。
    酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。为此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变化进行优化控制。
     固体培养是以皮麸或米糠为主要原料，另外添加谷糠、豆饼等为辅助原料。经过对原料发酵前处理，在一定的培养条件下微生物进行生长繁殖代谢产酶。固体培养法比液体培养法产酶量高。同时还具有原料简单、不易污染、操作简便、酶提取容易、节省能源等优点。缺点是不便自动化和连续化作业，占地多、劳动强度大、生产周期长。
    液体培养法的优点是：占地少、生产量大、适合机械化作业、发酵条件容易控制、不易污染，还可大大减轻劳动强度。其培养方法有分批培养、流加培养和连续培养三种，其中前两种培养法广为应用，后者因污染和变异等关键性技术问题尚未解决，应用受到限制。在深层液体培养中，pH值、通气量、温度、基质组成、生长速率、生长期及代谢产物等都对酶的形成和产量有影响，要严加控制。深层培养的时间通过监测培养过程的酶活来确定，一般较固体培养周期(1~7d)短，仅需1~5d。与固体培养法相比，
    提高微生物酶活性和产率的途径是多方面的，其中控制营养和培养条件是最基本也是最重要的途径。改变培养基成分，常常能提高酶活性，改变培养基的氢离子浓度和通气等条件，可以调节酶系的比例，改变代谢调节或遗传型，可以使酶的微生物合成产生成千倍的变化。上述的这些措施，对于微生物产酶的影响并非孤立的，而是相互联系、相互制约的。所谓最佳培养条件与培养基的最佳组成，都是保证酶合成达到最高产率的控制条件。通常，菌种的生长与产酶未必是同步的，产酶量也并不是完全与微生物生长旺盛程度成正比。为了使菌体最大限度地产酶，除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的产酶培养基外，还应当为菌种在各个生理时期创造不同的培养条件。例如细菌淀粉酶生产采取"低浓度发酵，高浓度补料"，蛋白酶生产采取"提高前期培养温度"等不同措施，提高了产酶水平。
碳水化合物是微生物细胞的重要组成材料、能源和酶的组成部分，也是多种诱导酶的诱导物。不同微生物要求的碳源不同，是由菌种自身的酶系（组成酶或诱导酶）所决定。
综合起来有如下几点值得注意：葡萄糖、蔗糖等易利用的碳水化合物，对促进细胞的呼吸与生长有利。高浓度下，对产酶有抑制作用，如蛋白酶和α-淀粉酶等就是如此，也有与此相反的情况；有些微生物不能利用复杂的碳水化合物，必须使用葡萄糖等简单的碳水化合物时，可采用流加法等避免出现"葡萄糖效应"现象；有时近似的碳源，也会因某些原因，出现不同的产酶情况，如黄青霉（葡萄糖氧化酶产生菌）在甜菜糖蜜作碳源时不产酶，以甘蔗糖蜜作碳源时产酶量显著增高。此外，碳源类型除了影响产酶外，还能影响微生物胞内酶与胞外酶的比例。
    有些碳源本身就是酶的诱导物，如短乳杆菌（葡萄糖异构酶产生菌）必须在木糖培养基上产酶，以葡萄糖作碳源时，尽管菌体繁殖旺盛却不产酶。当然也有不需木糖作诱导物的葡萄糖导构酶产生菌。至于α-淀粉酶生产培养基中加入淀粉，果胶酶生产时加入果胶或含果胶物质的甜菜渣和水果渣，这都是早为人所共知的诱导物。但是不以底物作诱导物的情况也很多，如以果糖代替果胶，却能使果胶酶活性提高二倍。乳糖不仅诱导果胶酶，也能诱导绿色木霉增加纤维素酶的产量。
    诱导方法有： 直接诱导法，即将诱导剂直接加入培养基中，使之发酵产酶；两步培养诱导法，先将微生物接种在不含诱导剂的培养液中，繁殖大量菌丝。在产酶期，把菌体转入含诱导剂的培养液中，使之大量合成酶。两步法提高产酶的原因，可能是这种方法可以避免分解代谢物阻遏，使诱导物能充分发挥其诱导作用；二次诱导法，如焦曲霉在乳糖做碳源时，能产生少量a-半乳糖苷酶，焦曲霉也能在棉子糖诱导下合成α-半乳糖苷酶。若在培养液中先加少量棉子糖，使之起预诱导作用，然后在菌体进入大量合成酶的生长时期，再加入适量的乳糖，进行二次再诱导，可能合成较多的a-半乳糖苷酶。
    氮源是蛋白质的组成成分，氯源的不同，也能起到诱导和阻遏酶形成的作用。在蛋白酶生产中，蛋白质能诱导酶的形成，而它的水解物就不及它本身好。氨基酸的作用变化很大，有的有利，有的抑制。
    氮源对于微生物生长与产酶有几方面影响：既促进微生物生长，又促进产酶；只促进微生物生长，不促进产酶；只促进产酶，不促进微生物生长；既不促进微生物生长，又不促进产酶。
    在严格选定氮源类型之后，还应当注意碳源浓度，即碳氮比、无机氮与有机氮的浓度比例、无机氮的种类等。在曲霉淀粉酶的生产过程中，如果碳源不足，不能得到充分的能源，菌丝体对于氮源的消耗显著降低，影响淀粉酶的合成。枯草杆菌产生果聚糖蔗糖酶时，培养基中蔗糖浓度10%，铵盐[如(NH4)SO4]浓度必须超过菌体生长的最高需要量（即达到含氮量0。15%左右），酶的产量才大幅度上升。
有些金属离子本身就是酶的组成部分。盐对产酶的效应比较复杂，现分述如下：
    磷：多数情况对产酶有促进作用，在蛋白酶中比较明显；
    钙：Ca2+对蛋白酶有明显的保护和稳定作用。如无Ca2+存在时，灰色链霉菌中性蛋白酶只在PH7~7.5很狭范围内稳定，当有Ca2+存在时，稳定pH范围扩大到5~9，在Ca2+存在下，枯草杆菌中性蛋白酶在pH5.5~10可以稳定数小时，其反应最适温度可以提高到57℃。一种真菌产生的碱性蛋白酶，在Ca2+存在时，37℃时的半衰期由7.5min延长到165min。有Ca2+时半数以上碱性蛋白酶可在65℃维持15min。50℃培养的耐热蛋白酶，在Ca2+存在下80℃加热10min、酶活尚存85%，无Ca2+时76℃经10min，酶活即下降50%。Ca2+对α-淀粉酶的作用更为明显，纯化的α-淀粉酶在50℃以上容易失活，但有大Ca2+存在时，酶的热稳性增加。不同的菌种热稳性提高到65℃至90℃。 PH的稳定范围也从5~7扩展至5~11。α-淀粉酶是一种金属酶，每分子酶含1克原子Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持最大的活性与稳定性。不同菌种热稳定性的不同是由于高温对Ca2+的亲和力不同所致。α-淀粉酶与Ca2+的结合不因EDTA的处理而失活，除非pH低于3，但若添加与EDTA相当量的Ca2+，并将其复至中性，仍可恢复活性。
    添加适量的Mg2+，Zn2+，Mn2+，Co2+，Fe2+等能提高蛋白酶和α-淀粉酶等的产酶量。D-木糖异构酶需要二价金属离子才有活力，不同菌种需As2+，Mg2+，Mn2+和Co2+等，在一种情况下，一种离子可能是活化剂，在另一种情况下却成了抑制剂。不同的酶往往需要不同的离子作它的活化剂。
多种氨基酸维生素是微生物生长与产酶的必要成分，有些维生素甚至就是酶的组成部分。麦芽根、酵母膏、玉米浆、米糠、曲汁、麦芽汁、玉米废醪中均含有不同程度的微量生长因素，对促进产酶有显著效应。磷酸酰环己六醇也是微生物的重要生长因素之一。
    同一菌种产酶的类型与酶系组成可以随pH值的改变而产生不同程度的变化。如用黑曲霉使腺苷酸氧化脱氨转变为肌苷酸时，培养在pH值6.0以上的环境中，果胶酶活性受到抑制，pH值改变到6.0以下就形成果胶酶。pH值还决定酶系的组成，泡盛曲霉突变株在pH值6.0培养时，以产生a-淀粉酶为主，糖化型淀粉酶与麦穿糖酶产生极少。在pH值2.4条件下培养，转向糖化型淀粉酶与麦穿糖酶的合成，α-淀粉酶的合成受到抑制。
    在蛋白酶生产中，pH低有利于酸性蛋白酶生成，pH高有利于中性和碱性蛋白酶生成，这是相一致的。产酶pH值常同酶反应最适pH值接近，但酶反应的最适pH也许对某些酶最不稳定，在这种场合下只能选择尽量靠近的pH值。
    在有些情况下，由于pH不同，出现胞内和胞外酶的产量比例不同，如α-半乳糖苷酶在PH4.8至6.0范围内，其胞内酶占74%。当pH升高时胞外酶的比例就升高。
    产酶温度低于生长温度。酱油曲霉蛋白酶合成的适宜温度在28℃，比生长温度40℃条件下产酶量高出2~4倍。在异淀粉酶生产中也有这种情况；
    产酶温度与生长温度一致。如链霉菌合成葡萄糖异构酶约在30℃；
    产酶温度高于生长温度。例如产生糖化型淀粉酶的适宜温度在35℃，而它生长的最适温度为30℃。链霉菌产生淀粉酶的温度以35℃合适，而生长温度则以28℃最好；
    此外，温度还能影响酶系组成及酶的特性。例如，用米曲霉制曲时，温度控制在低限，有利于蛋白酶合成，而α-淀粉酶活性受到抑制。
    以枯草杆菌产生α-淀粉酶为例。将细菌的生理时期划分为三个阶段：菌体繁殖期，接种后5~13h；
芽胞产生期；产酶期。这三个阶段对于供氧要求是不同的。如果第二时期维持缺氧状态，有助于抑制芽胞形成，第一和第三生理时期充分供氧，可以促进菌体繁殖并提高产酶量，证明不同时期，对通气量要求不同。
对于产异淀粉酶的气杆菌，不同的通气量和培养方式，酶活亦有很大差别。产异淀粉酶的气杆菌，生长期间要求有较大的通气量，而产酶期间通气量以小为好；就生长而论，通气量以中等程度较好。也有与此相反的情况，如蛋白深层发酵时，较小通气量有利于生长，不利于产酶，较大通风量可促进酶的合成而对生长则抑制。但异构酶产生菌因菌种不同，有的在强通风下产酶，有的需弱通风下产酶。
    过老或过嫩，不但延长发酵周期，而且会降低产酶量。一般种龄在30至45h的酶活性最高。
    微生物酶的提取方法，因酶的结合状态与稳定性的不同，应用部门对产品的纯度要求不同，而有一定的区别。如果提取到的酶是一种可溶于水的复杂混合物，则需要进一步加以纯化。适用于大生产的提纯方法总是以降低成本、提高效能而同时又提高产品纯度和质量为前提，事先应当经小试验规模充分对比，从中加以选择。理想的提纯方法应满足二个条件，即比活性的提高与总活性的回收高，但实际上往往难以兼得。
    盐析剂中性盐的选择： MgS04，(NH4)2S04，Na2SO4，NaH2P04是常用的盐析用中性盐。其盐析蛋白质的能力随蛋白质的种类而不同，但一般说来这种能力按上述顺序依次增大。一般可以说含有多价阴离子的中性盐其盐析效果好。但实际上(NH4)2S04是最多用的盐析剂，这是因为它的溶解度在较低温度下也是相当高的。有的酶只有在低温下稳定，而低温下Na2S04，NaH2P04的溶解度很低，常常不能达到使这种酶盐析的浓度。
    盐析剂用量的决定：不同的酶使之盐析沉淀的盐析剂用量是不同的，随共存的杂质的种类和数量而有所差异。因此适当的使用量只能根据实践决定，并根据数据可以绘制出盐析曲线。
    pH和温度的影响：蛋白质的溶解度在无盐存在下，以在等电点时为最小，在稀盐状态时大致也是这样。但在高浓度的中性盐溶液中，原有蛋臼质溶液pH的影响不大。实际上溶液最终的pH为盐析剂所决定。
    在无盐或稀盐溶液中，温度低，蛋白质的溶解度也低，但在高浓度盐溶液中，温度高则蛋白质的溶解度反而低。因此一般说来盐析时不要降低温度，除非这种酶不耐热。
盐析法的优点是在常温沉淀过程中不会造成酶的失活，沉淀物在室温下长时间放置也不会失活，在沉淀酶的同时夹带沉淀的非蛋白质杂质少，而且适用于任何酶的沉淀。它的缺点是沉淀物中含有大量的盐析剂。如用硫酸按一次沉淀法制取的酶制剂，就含有硫酸铵的气味，如果这种制剂不经脱盐直接用于食品工业，不但影响食品的风味和工艺效果，而且工业硫酸铵中可能含有毒性物质，不符合卫生要求。
    有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质的种类及有机溶剂的种类而不同，对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂的沉淀能力，丙酮>异丙醇>乙醇>甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度所影响，不是一成不变的。
    有机溶剂的沉淀能力受很多因素影响，特别是溶存盐类的影响尤为显著。当存在少量中性盐(0.1~0.2mol/L以上)时能产生盐溶作用。蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度升高。多价阳离子如Ca2+，Zn2+与蛋白质结合，就能使蛋白质在水或有机溶剂中的溶解度降低，因而可以降低使酶沉淀的有机溶剂的浓度。
    有机溶剂沉淀蛋白质的能力受温度的影响很大。一般言之，温度愈低沉淀愈完全。局部区域有机溶剂过浓，能够严重破坏蛋白质的空间结构造成酶的变性失活，在温度较高的条件下尤为显著。有机溶剂，特别是乙醇与水混合时放出大量热，使混合液的温度升高。因此在添加有机溶剂时，整个系统需要冷却，一般保持0℃左右，同时强烈搅拌，以避免有机溶剂局部过热和液体局部过热。另外，已经沉淀的酶对有机溶剂变性的抵抗力大，所以过分延长添加溶剂的时间也是不利的。
    蛋白质在等电点的溶解度最低，但很多酶的等电点在pH4~5值之间，比其稳定的pH值范围低。在这种情况下必须采用目的酶稳定的pH值，然后是尽可能靠近其等电点。
    沉淀时酶液的温度和pH值不但对目的酶的收率具有决定性的影响，而且对酶的组成(各共存酶的比率)及单位重量沉淀物中目的酶的活力都有重要的关系。例如固体培养的米曲霉α-淀粉酶，用水抽出并过滤，清液预先冷却，在搅拌下加乙醇至终浓度70%，温度10℃，pH值5.6~6.0，α-淀粉酶的收率约94%。
    白土类是以硅酸铝为主要成分的粘土，随其种类不同，能吸附酶或蛋白质的种类和数量也不同，一般在弱酸性条件下吸附酶或蛋白质，在中性或弱碱性条件下解吸。白土先用2mol/L盐酸活化。
    活性氧化铝也是最常用的吸附酶或蛋白质的吸附剂之一。可以用明矶、硫酸铵等调制，加热使之活性化。酶或蛋白质一般在弱酸性条件下吸附，在弱碱性条件下解吸。
一定的酶只作用于特定的基质，这一事实说明两者之间有一种特别的亲和力。因此用基质吸附那种对基质具有特定作用的酶，可以达到很好的效果。但作为吸附剂的基质首先必须是固相物；其次在吸附酶的过程中，这种基质不会被它所吸附而又专门能作用于它的酶所分解，或分解程度极微；第三是单位重量的基质吸附这种特定酶的能力均应该足够大。现发现生淀粉对α-淀粉酶的吸附是比较接近于上述条件的。
浓缩的酶液可制成液体或固体酶制剂。酶制剂的出售是以一定体积或重量的酶活计价，所以生产出的酶制剂在出售前往往需要稀释至一定的标准酶活。同时为改进和提高酶制剂的储藏稳定性，一般都要在酶制剂中加入一种以上的物质，它们既可作酶活稳定剂，又可作抗菌剂及助滤剂，它们若制成干粉，则可起到填料、稀释剂和抗结块剂的作用。可用作酶活稳定剂的物质很多，如辅基、辅酶、金属离子、底物、整合剂、蛋白质等，最常用的有多元醇(如甘油、乙二醇、山梨醇、聚乙二醇等)、糖类、食盐、乙醇及有机钙。有时用一种稳定剂效果不明显，则需要几种物质合用，如明胶对细菌淀粉酶及蛋白酶有稳定作用，但效果不明显，若同时加人些乙醇和甘油，稳定效果就显著了
随着人们对食品的要求不断提高和科学技术的不断进步，一种崭新的食品保鲜技术—酶法保鲜技术正在崛起。酶法保鲜技术是利用生物酶的高效的催化作用，防止或消除外界因素对食品的不良影响，从而保持食品原有的优良品质和特性的技术。由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等特点，可广泛地应用于各种食品的保鲜，有效地防止外界因素，特别是氧化和微生物对食品所造成的不良影响。
葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase）是一种氧化还原酶，它可催化葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和双氧水。将葡萄糖氧化酶与食品一起置于密封容器中，在有葡萄糖存在的条件下，该酶可有效地降低或消除密封容器中的氧气，从而有效地防止食品成分的氧化作用，起到食品保鲜作用。
葡萄糖氧化酶可以在有氧条件下，将蛋类制品中的的少量葡萄糖除去，而有效地防止蛋制品的褐变，提高产品的质量；另外在氧的存在下容易发生氧化作用的花生、奶粉、面制品、冰淇淋、油炸食品等富含油脂的食品；易发生褐变的马铃薯、苹果、梨、果酱类食品中，利用葡萄糖氧化酶这种理想的除氧保鲜剂，可以有效地防止氧化的发生。
溶菌酶（Lysozyme）是一种催化细菌细胞壁中的肽多糖水解的水解酶。它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使细菌溶解死亡。一般可从鸡蛋的蛋清中得到。用溶菌酶处理食品，可以有效地防止和消除细菌对食品的污染，起到防腐保鲜作用。溶菌酶由于其专一地作用于细菌的细胞壁，使细菌溶解，而对没有细胞壁的人体细胞不会产生不利的影响，所以广泛地应用于医药、食品等需要杀灭细菌的领域。在食品保鲜方面，可用于各种食品的防腐保鲜等，如干酪、水产品、低浓度酿造酒、乳制品等其它食品的保鲜。采用溶菌酶进行食品的防腐保鲜，一般使用蛋清溶菌酶。蛋清溶菌酶对人体无害，可有效地防止细菌对食品的污染，它已广泛地用于各种食品的防腐保鲜。
淀粉类食品是指含大量淀粉或以淀粉为主要原料加工而成的食品，是世界上产量最大的一类食品。淀粉可以通过水解作用生成糊精、低聚糖、麦芽糊精和葡萄糖等产物。这些产物又可进一步转化为其他产物。在这些产物的生产中，已广泛应用各种酶。
在淀粉类食品的加工中，多种酶被广泛地应用，其中主要的有a-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、支链淀粉酶、葡萄糖异构酶等。现在国内外葡萄糖的生产绝大多数是采用淀粉酶水解的方法。酶法生产葡萄糖是以淀粉为原料，先经a-淀粉酶液化成糊精，再利用糖化酶生成葡萄糖。果葡糖浆是有葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖，而得到含有葡萄糖和果糖的混合糖浆。若将异构化反应完成后，混合糖液经过脱色、精制、浓缩等过程，得到固形物含量达71%左右的果葡糖浆，其中，含果糖42%左右，含葡萄糖52%左右，另有6%左右为低聚糖。若将异构化后的混合糖液中的果糖与葡萄糖分离，再将分离的葡萄糖进行异构化，如此反复进行，可使更多的葡萄糖转化为果糖，由此可生产出果糖含量达70%、90%甚至更高的果葡糖浆，称之为高国糖浆。
饴糖生产中所利用的酶，除了从添加的大麦芽中得到以外，也可以采用直接添加酶制剂的方法提供。添加的酶主要是a-淀粉酶和β-淀粉酶。目前高麦芽糖浆的生产的生产是采用β-淀粉酶和支链淀粉酶的共同作用，使淀粉更多地转化为麦芽糖。糖化时，将液化后得到的糊精液调至pH5~6，温度50℃左右，加入一定比例的支链淀粉酶和β-淀粉酶，作用10h左右，得到麦芽糖含量达80%~95%的糖化液。
糊精是淀粉的低级程度水解产物，广泛应用于食品增绸剂、填充剂和吸收剂等。糊精和麦芽糊精可用酸法和酶法生产，现在大多采用酶法水解的方法生产。环状糊精是由6~12个葡萄糖单位以a-1，4-葡萄糖苷键连接而成的环状结构的一类化合物，能吸附各种小分子物质，起到稳定、缓解、乳化、提高溶解度和分散度等作用，在食品工业中有广泛用途。β-环状糊精的生产，一般采用嗜碱芽孢杆菌BGT。常用的生产菌株有N-227，NO。38-2等。采用嗜碱芽孢杆菌N-227菌BGT生产β-环状糊精时，可使用木薯淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉及可溶性淀粉为原料，转化率可达35%~40%。
蛋白质食品是指含大量蛋白质或以蛋白质为主要原料加工而成的食品。在蛋白质食品的生产过程中，主要使用的酶是各种蛋白酶。蛋白质是由各种氨基酸通过肽键连接而成的高分子化合物，在蛋白质水解酶的作用下，可水解生成蛋白胨、多肽、氨基酸等蛋白质水解产物。这些产物在食品、医药、细菌培养等领域有广泛的应用价值。
蛋白酶（Proteinases）是一类催化蛋白质水解的酶。来自微生物的蛋白酶主要是枯草杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶等。蛋白质在加酶水解之前必须经过一定的处理，以破坏其完整的空间结构，使其变性，以利于酶的水解。一般可以采用加热处理的方法。也可采用生化分离技术将蛋白质先提取出来，再进行酶解。用蛋白酶水解法生产氨基酸时，要根据所使用的蛋白酶的动力学特性，选择并控制好各种水解条件，使蛋白质完全水解成氨基酸。
明胶是一种热可溶性的蛋白质凝胶，在食品加工中有广泛的用途。生产明胶的原料一般采用动物的皮或骨，这些原料含有丰富的胶原蛋白。天然状态的胶原蛋白呈三股螺旋结构，不溶于水，若采用适当的方法处理，即可使三股螺旋结构解体成为单链，而溶解在热水中，得到明胶溶液。在蛋白酶法水解生产明胶时原料需先经切割、捣碎处理，然后用清水洗净、沥干。
干酪（cheese）又称奶酪，是乳中的酪蛋白凝固而成的一种营养价值高、容易消化吸收的食品，其主要成分是蛋白质和乳脂，还含有少量的无机盐及丰富的维生素。干酪的生产可以采用乳酸菌发酵的方法，也可采用凝乳蛋白酶的方法进行。用于肉类嫩化的微生物蛋白酶有枯草杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、米曲霉蛋白酶、根曲霉蛋白酶等微生物蛋白酶。
在果蔬类食品的生产过程中，为了提高产量和产品质量，常常使用各种酶。常用果胶酶处理果汁、果酒、果胨、果蔬罐头等的生产。在果汁生产过程中，应用果胶酶处理，有利于压榨、提高出汁率。在沉淀、过滤、离心分离过程中，能促进凝聚沉淀物的分离，使果汁澄清。经酶处理的果汁比较稳定，可防止混浊。果胶酶已广泛用于苹果汁、葡萄汁、柑橘汁等的生产。用于果汁处理的果胶酶一般均是混合果胶酶，其中含有果胶酯酶（PE）、内切聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）、外切聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）、内切聚半乳糖醛酸裂解酶（endo-PGL）、外切聚半乳糖醛酸裂解酶（exo-PGL）、内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（endo-PMGL）、外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（exo-PMGL）。在应用果胶酶处理苹果汁时，要特别注意pH值、温度、作用时间、酶量等对果汁澄清速度的影响。
果汁经浓缩成为高浓度果汁后，在高浓度的糖存在的条件下，可以凝结形成果冻。但糖含量太多不仅影响风味，而且不符合当今人们对健康食品的要求。若要生产低糖果冻，必须采用酶法处理技术。用纯化的果胶酯酶（PG）处理果汁，使果胶的甲基化程度降低。
在果蔬制品的脱色方面也用到酶制剂处理。许多水果和蔬菜，如葡萄、桃、草莓、芹菜等都含有花青素。花青素是一类水溶性植物色素。其颜色随pH值的不同而改变，在光照和稍高的温度下，很快变为褐色，与金属离子反应则呈灰紫色。因此，含花青素的果蔬制品，如葡萄汁、草莓酱、桃子罐头、芹菜汁等，必须用花青素酶处理，使花青素水解成为五色的葡萄糖和配基。以保证产品质量。
在葡萄酒生产的过程中，已广泛应用酶制剂，主要应用的酶有果胶酶和蛋白酶。果胶酶用于葡萄酒生产，不仅可以提高葡萄汁和葡萄酒的产率、有利于过滤和澄清，而且可以提高产品质量。如使用果胶酶后，葡萄中单宁的抽出率降低，使酿制的白葡萄酒风味更佳。在红葡萄酒酿制过程中使用果胶酶，可提高色素的抽提率，还有助于酒的老熟，增加酒香。
用于葡萄酒生产的果胶酶大多数是复合酶制剂。除了含有各种果胶酶外，还含有少量的纤维素酶和半纤维素酶。在葡萄酒酿造过程中，还使用蛋白酶，以使酒中存在的蛋白质水解，防止出现蛋白质浑浊，使酒体清澈透明。除了葡萄酒以外，在其他果酒如桃酒、荔枝酒等的生产过程中，也可采用酶法处理，以提高产率和产品质量。
酶作为一种高效生物催化剂，逐渐在食品添加剂的生产中获得较广泛的应用。介于天然提取和化学合成两种方法之间，酶合成的工艺具有前两者无法比拟的优点：酶的催化活性高，产品合成速度快，酶的催化特异性，产品纯度高，且能获得指定构象的产品。酶的使用确实能解决化学合成和天然提取方法中的问题，也就为食品添加剂的生产提出新的思路。

胞内体是细胞器。胞内体膜上有ATP驱动的质子泵，能够将氢离子泵进胞内体腔中，进因此使腔内的pH下降，引发低密度脂蛋白与受体分离。 细胞器由植物细胞内膜包围，关键效果是运输由胞吞效果新摄取的物质，直到溶酶体被降解。出现肺炎衣原体细菌感染，提议去医院门诊救治呼吸科，需要时服食左氧氟沙星片，阿奇霉素片。