巴比妥毛细管电泳中缓冲液的作用电泳

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-11-08 07:18 标签： 毛细管电泳中缓冲液的作用

1、琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 Agarose Gel Electrophoresis概概 述述 凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰 胺等物质作支持体的电泳。胺等物质作支持体的电泳。 特点：特点： 1.1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔 中泳动。中泳动。 2. 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快 3. 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状 高聚物。 琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin） Acid sulfateCarboxylic acid groups在电场作用下能产生较强的电渗现象琼脂糖半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作 用使其互相盘绕

2、形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型 凝胶。凝胶。 D-D-半乳糖半乳糖3 3，6-6-脱水脱水- -L-L-半乳糖半乳糖琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点（一）优点（一）优点 1.1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合 物、核酸、病毒物、核酸、病毒 等大分子物质等大分子物质。 4.4.透明度较好透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.5.不吸收紫外光不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量，可直接利用紫外光吸收法作定量 测定测定 6.6.有热可逆性有热可逆性（二）缺点（二）缺点 1.1.机械强度差机械强度差，易破碎，浓度不能太低。，易破碎，浓度不能太低。 2.2.易被细菌污染易被细菌污染，不易保存，临用前配制。，不易保存，临用前配制。 3.3.琼脂糖支持层上的琼脂糖支持层上的区带易于扩散区带易于扩散

3、，电泳后，电泳后 必须立即固定染色。必须立即固定染色。 4.4.与与PAGEPAGE相比，相比，分子筛作用小分子筛作用小，区带少。，区带少。 应应 用用1. 1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、 鉴定及纯化鉴定及纯化 2. 2. 临床生化检验中常用于临床生化检验中常用于LDHLDH、CKCK等同工酶等同工酶 的分离与检测的分离与检测 3. 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提 供生化指标供生化指标琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白原理血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后， 以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比 妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成 、大小、形状分离成不同区带。 ( (一一) )血清脂蛋白血清脂蛋白(

4、胆固醇 （FCFC）胆固醇酯胆固醇酯 （CECE） 少量糖少量糖（二）分类（二）分类 1. 1. 按电泳法分按电泳法分乳糜微粒（乳糜微粒（chylomicronchylomicron,CM,CM） - -脂蛋白脂蛋白 （ - -位）位）前前 - -脂蛋白（脂蛋白（ 2 2- -位）位） - -脂蛋白脂蛋白 （ 1 1- -位）位） 2. 2. 按超速离心法分按超速离心法分乳糜微粒乳糜微粒( (chylomicronchylomicron, ,CM)CM) ( pIpI ，各种脂蛋白均带负电，电各种脂蛋白均带负电，电 泳时由负极到正极；泳时由负极到正极；VLDLVLDL为圆形，受阻力为圆形，受阻力 小，小，LDLLDL形态不规则，受阻力大，所以形态不规则，受阻力大，所以VLDLVLDL 跑在前。跑在前。加样槽加样槽 前前 CM LDL VLDL HDLCM LDL VLDL HDL+ +临床应用：高脂蛋白血症的分型CM 前 正常 型 a型 b型 型 型 型操作玻璃片预染色的标本预染色的标本正常参考值（百分比） -脂蛋白 30-40% 前-脂蛋白 15% -脂蛋白 55%l l注意事项：注意事项：血清样品要新鲜；血清样品要新鲜；为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应 吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣 ，否则应再离心后吸预染血清，否则应再离心后吸预染血清。 名词解释名词解释 1.1.迁移率迁移率 2.2.电渗电渗 3.3.电泳电泳 问答题问答题 1.1.影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。复习思考题复习思考题参参 考考 书书 目目临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验 第三版第三版人民卫生出版社人民卫生出版社 周新周新 主编主编电泳科学出版社电泳科学出版社 何忠效何忠效 张树政张树政 主编主编蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术 科学出版社科学出版社 郭尧君郭尧君蛋白质技术手册蛋白质技术手册 科学出版社科学出版社 汪家政汪家政 范敏范敏 主编主编

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了解火箭免疫电泳技术。

immunoelectrophoresis)又称单向定量免疫电泳。在琼脂内掺入适量的，在电场作用下，定量的抗原泳动遇到琼脂内的抗体，形成抗原-抗体复合物沉淀下来。走在后面的抗原继续在电场作用下向正极泳动，遇到琼脂内沉淀的抗原-抗体复合物，抗原量的增加造成抗原过量，使复合物沉淀溶解，一同向正极移动而进入新的琼脂内与未结合的抗体结合，又形成新的抗原-抗体复合物沉淀下来，不断地沉淀-溶解-再沉淀，直至全部抗原和抗体结合，在琼脂内形成锥形的沉淀峰，称火箭电泳。火箭峰的长度与标准抗原比较，可计算待测抗原的浓度。

本实验以人血清作为抗原，免疫(家兔)产生抗血清，当适量抗原、抗体在中扩散，两者相遇时，则形成抗原-抗体复合物的白色沉淀线。不同的抗原分子与相应的抗体分子的扩散速度不同，当两者间比例适当时，出现数目不同的沉淀线，根据沉淀线的出现可以定性抗原、诊断疾病或测定抗体的效价。

2.免疫血清(抗血清):家兔抗人胎甲球蛋白血清。

3.琼脂糖(或分装琼脂粉)。

4. pH 8.6电极(巴比妥缓冲液)(离子强度0.05m):取巴比妥1.84g，巴比妥钠10.3g溶于，定溶至1L。制备琼脂溶液时需要将上述缓冲稀释一倍，离子强度为0.025m。

5.、打孔器、微量取液器、稀释板、培养器或带盖。

1.抗体琼脂板的制备:将融化的琼脂冷却到55℃，加入适量(看免疫血清的效价高低而定)的抗体，立即混匀(不要出现泡沫)，将上述的抗体琼脂(大约20ml)制成琼脂板，冷却后按图15-1所示打孔备用。

2.加样:在各孔里加入不同稀释度的抗原。

3.电泳:在平板电泳槽里倒进离子强度m= 0.05的巴比妥缓冲液。将凝胶板平放在电泳槽中的隔板上。琼脂的两端用浸湿的滤纸做桥与电泳槽的电极缓冲液相连接，抗体端接正极。通电，强度按琼脂板的宽度计算(1～2mA/cm)。观察到白色沉淀线时，即电泳完毕(一般1h左右)。一般通电后调电压为10V/cm，或电流强度为2～4mA/cm，时间为1～5h。

4.抗原定量:在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后可以用肉眼观察并量出已知抗原量的各个火箭的高度，绘出标准曲线，便可测出未知浓度的抗原量。如果精确计算，可用求积仪测定峰的面积。

1.影响单向定量免疫电泳的因素很多，主要是要选择好抗体浓度，使抗原和抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的抗体量，如效价高，则免疫血清琼脂的比例为1∶5～1∶9，如效价低，则免疫血清与琼脂的比例为2∶5。

2.加入的抗体量要合适，以保证抗原、抗体的合适比例，以便形成清晰的沉淀峰。抗体的准确用量应通过预实验来决定，即:加入不同量的抗血清，用一定量的抗原进行火箭电泳，选出沉淀峰在2～5cm之间的相应抗体浓度就是合适的抗体用量。

3.所用琼脂可选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则。

4.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。

5.数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源(电流要小)后再加样品。否则易形成宽底峰形，使定量不准。

6.作IgG定量测定时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可用与IgG上的氨基结合(甲酰化)，使本来带两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。

7.火箭电泳作为抗原定量只能测定Mg/ml以上的含量，如低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。加入少量125I标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰;经洗涤干燥后，用X线显影，可出现放射性显影，这是目前采用较多的放射自显影技术。根据自显影火箭峰降低的程度()可计算出抗原的浓度。放射免疫自显影技术可测出ng/ml的抗原浓度。

简述火箭免疫电泳的原理。

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