(急)微生物的纯化培养技术分离中如何保证实验数据梯度及一致性?你认为实验中应注意的操作有哪些?

 乙型肝炎病毒DNA定量检测试剂注册申报资料技术指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒(以下简称乙肝病毒)DNA定量检测试剂注册申报资料的准备及撰写,同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是对乙肝病毒DNA定量检测试剂的一般要求,申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用,若不适用,需具体阐述理由及相应的科学依据,并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则不包含的研究内容,可自行补充。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件,但不包括注册审批所涉及的行政事项,亦不作为法规强制执行,如果有能够满足相关法规要求的其它方法,也可以采用,但需要提供详细的研究资料和验证资料,相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的,随着法规和标准的不断完善,以及科学技术的不断发展,本指导原则相关内容也将适时进行调整。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。全球每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌),肝癌患者中,75%以上由HBV所致。
    我国属HBV感染地方性流行区。根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查,我国现有的慢性HBV感染者约9300万人,其中慢性乙型肝炎患者约2000万例,每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡约30余万例,新发乙型肝炎病例约50~100万例。乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。

HBV是血源传播性疾病,主要经血(如不安全注射等)、母婴及性接触传播。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),基因组长约3.2 kb,为部分双链环状DNA。急性乙型肝炎病毒感染HBV DNA存在先阳性后消失的发展过程,慢性乙型肝炎病毒感染的自然史一般可分为4个期,即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低(非)复制期和再活动期,其中免疫耐受期HBV DNA滴度较高(大于20 000 IU/ml),免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml,但一般低于免疫耐受期。非活动或低(非)复制期和再活动期可表现为HBV DNA检测不到(PCR法)或低于检测下限。但并不是所有HBV感染者都经历以上四期。

HBV已发现有9个基因型(A~I),每个基因型又可分为不同亚型,且存在基因型之间的重组现象。我国已发现A、B、C、D基因型,中东部地区以B、C基因型占优势,其中北方地区(长江以北)主要为C2亚型;南方大部分地区流行株为B2、C2、C1亚型,并有少部分D基因型;西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主,西部藏族居民中以C/D重组基因型为主;A型和B1亚型罕见。

乙肝病毒DNA定量检测试剂是指利用包括实时荧光PCR或其他的分子生物学方法在内的核酸检测技术,以乙肝病毒基因序列为检测目的,的试剂。结合临床表现和其他实验室指标,可作为乙肝辅助诊断的指标之一,还可通过对血中HBV DNA水平的监测,用于HBV感染的诊断、治疗适应证的选择及抗病毒疗效的判断。本试剂不用作HBV的血源筛查。

本指导原则主要针对实时荧光PCR方法的乙肝病毒DNA定量检测试剂,其它核酸定量检测方法可参照本指导原则,但应根据产品的具体特性确定其中内容是否适用,如不适用,应另行选择适用自身方法学特性的研究步骤及方法。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容,其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及检出限等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。应符合《体外诊断试剂注册管理办法(试行)》(以下简称《办法》)和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》(国食药监械[号)的相关要求。

说明书承载了产品预期用途、试验原理、试验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息,是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据,因此,产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求,境外试剂的中文说明书除格式要求外,其内容应尽量保持与原文说明书的一致性,翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致,如某些内容引用自参考文献,则应以规范格式对此内容进行标注,并单独列明文献的相关信息。

结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求,下面对乙肝病毒核酸检测试剂说明书的重点内容进行详细说明,以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。

1.【预期用途】  应至少包括以下几部分内容:

(1)试剂盒用于定量检测人血清和/或血浆等样本中的乙肝病毒DNA,适用样本类型的确定应结合实际的临床研究完成情况进行确认。

(2)待测人群特征介绍:主要为接受抗病毒治疗的乙肝患者。

(3)临床用途:主要通过对乙肝患者血中HBV DNA基线水平和变化情况的监测,用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。(如有其它用途应作特别说明。)

(4)强调:该检测不得作为患者病情单独的评价指标,必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价。

(5)明确说明该检测不得作为血液筛查HBV病毒的筛查试剂使用。

(1)说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息,定量标准品、阴/阳性对照品(或质控品)可能含有人源组分,应提供其生物学来源、活性及其他特性;说明不同批号试剂盒中各组份是否可以互换。

(2) 试剂盒中不包含但该项检测必需的组份,说明书中应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其它相关信息。

(3)如果试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分,则应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及产品货号等详细信息。

3.【储存条件及有效期】

试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等。应标明具体的储存条件及效期。

(1)样本采集时间点的选择:按照慢性乙型肝炎防治指南(2010年版或新版)采样要求。

(2)对血液样本应当说明对采血管及抗凝剂的要求:明确样本类型、采血管和抗凝剂。其他样本应说明样本采集、处理及保存方式。

(3)样本运送、处理及保存:对血样离心条件的要求,核酸提取前的预处理、保存条件及期限(短期、长期)、运送条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复至室温,冻融次数的要求。如有需要应对高于检测范围的样本稀释方法进行规定。

5.【适用机型】注明所有适用的仪器型号,并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。

6.【检验方法】详细说明试验操作的各个步骤,包括:

(1)试验条件:实验室分区、实验环境的温度、湿度、空调气流方向控制等注意事项。

(2)试剂准备及配制方法、注意事项。

(3)详述待测样本及相关标准品、对照品(质控品)核酸提取的条件、步骤及注意事项。

  (4)核酸提取/纯化方法的详细介绍。

(5)扩增反应前准备:加样体积、顺序等。

(6)PCR各阶段的温度、时间设置、循环设置及相关注意事项。

(7)仪器设置:特殊参数、结合探针的荧光素标记情况对待测基因及内标的荧光通道选择。

(8)基线、循环阈值(Ct值)的选择方法。

(9)定标方法的描述。

(10)实验的有效性判断:试剂盒内阴/阳性对照品(质控品)的Ct值要求(包括内标)。

7.【检验结果的解释】

检验结果应用IU/mL表示,结合阴阳性质控结果,对低于检出限未检出、低于定量限、检测范围内及高于检测范围的检测结果分别进行界定。

8.【检验方法局限性】

(1)本试剂盒的检测结果仅供临床参考,对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

(2)不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。

(3)临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员,应严格按照说明书要求进行操作。

(4)明确该检测仅限于规定的样本类型及适用机型。

9.【产品性能指标】 详述以下性能指标:

(1)对相应国家参考品检测的符合情况。

(2)最低检出限及定量限:说明试剂不同样本类型的最低检出浓度和最低定量浓度,简单介绍最低检出限/定量限的确定方法以及对最低检出限/定量限验证所采用的基因型。

(3)精密度:精密度参考品的组分、浓度及评价标准。

(4)线性范围:确定线性范围的方法、浓度范围、相关系数等信息。

(5)对不同基因型的覆盖:验证该试剂对不同基因型的检测效果。

①临床特异性:应采用一定数量的临床HBV DNA阴性样本进行验证。

②交叉反应:易产生交叉反应的其它病原体核酸的验证情况,建议以列表的方式表示经过交叉反应验证的病原体名称、型别、浓度等信息;

③干扰物质:样本中常见干扰物质对检测结果的影响,如血红蛋白、甘油三酯、胆红素等,应注明可接受的最高限值;

④药物影响:常用抗病毒药物、干扰素对检测结果的影响,如未进行相关研究也应提供相关警示说明。

(7)对比试验研究(如有):简要介绍参比试剂(方法)的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。

10.【注意事项】应至少包括以下内容:

(1)有关人源组份(如有)的警告,如:试剂盒内对照品(质控品)或其它可能含有人源物质的组分,虽已经通过了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等项目的检测,但截至目前,没有任何一项检测可以确保绝对安全,故仍应将这些组份作为潜在传染源对待。

(2)实验室管理应严格按照国家有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。实验人员必须进行专业培训;实验过程应分区进行(试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区),实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备,各区各阶段用品不得交叉使用;各区间人员流动及空气流向应有严格要求,最大限度避免交叉污染;实验用消耗品(如离心管、吸头等)应有合理的清洁和质检程序,避免污染或扩增反应抑制物造成假阴性结果。

(三)拟定产品标准及编制说明

拟定产品标准应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》的相关规定。另外,对于首次申报注册的国产试剂,应参考《中国生物制品规程》(2000年版),将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后,并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。附录中应将待测靶基因的基因位点、全序列,引物/探针序列、来源及验证情况,各种酶的来源、特性以验证情况等信息的重点内容予以明确。

乙肝病毒核酸定量检测试剂的注册检测应符合国家参考品检测要求。产品的性能指标应与说明书内容相符。

如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布,则企业标准的要求不得低于上述标准要求。

根据《办法》要求,首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家标准品的乙肝病毒项目,在注册检测时应采用相应的国家标准品进行。

(五)主要原材料研究资料

应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产,其生产工艺必须相对稳定;如主要原材料来自市场(从其他单位购买),应提供的资料包括:对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告,以及该原材料到货后的质量检验资料。

1.企业内部参考品的制备、定值过程。建议采用灭活病毒建立参考品,不宜使用质粒。

2.核酸分离/纯化组分(如有)的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

3.PCR组分的主要材料(包括引物、探针、内标、各种酶及其它主要原料)的选择、制备、质量标准及实验研究资料,主要包括以下内容:

核酸的组成成分,包括:dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP,对纯度、浓度、保存稳定性等的详细验证资料。

由一定数量的dNTP构成的特定序列,通常采用DNA合成仪人工合成,合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等的验证。如为外购,应提供合成机构出具的合成产物的质检证明,如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。

特定的带有示踪物(标记物)的已知核酸片段(寡聚核苷酸片段),能与互补核酸序列退火杂交,用于特定核酸序列的探测。合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化,在5'-端(和/或3'-端)进行标记,如荧光素报告基团或其他发光标记物,在3'-端标记荧光素淬灭基团,并经HPLC或其他适宜方法纯化。纯度应达到HPLC纯,应提供合成机构出具的合成产物的质检证明,如HPLC分析图谱;应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实,并作HPLC分析。

DNA聚合酶,应具有DNA聚合酶活性,无核酸内切酶活性,具热稳定性,如:94℃保温1小时后仍保持50%活性;尿嘧啶糖基化酶(UNG),具有尿嘧啶糖基化活性,无核酸外切酶及核酸内切酶活性,应对酶活性有合理验证;应提供有关保存稳定性、活性及功能实验等的验证资料。

4.内对照(内标)、定标品、对照品(质控品)的原料选择、制备、定值过程及试验资料。内标可采用灭活的病毒或缺陷病毒(假病毒)、质粒。定标品及外部阳性对照宜采用灭活病毒或假病毒。

5.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和RNase污染。

(六)主要生产工艺及反应体系的研究资料

基本生产工艺主要包括:配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求,原材料应混合均匀,配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。

生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容,如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期,提供确切的依据,主要包括以下内容:

1.主要生产工艺介绍,可以图表方式表示。

3.基因位点选择、PCR方法学特性介绍。

4.DNA提取纯化方法优化,建议包含纯化步骤,内标、标准品、质控品均应全程参与提取纯化。不建议采用煮沸法进行DNA提取。

5.确定最佳PCR反应体系的研究资料,包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。样本量应不少于200微升、加样量应不少于20微升、反应体积应不少于40微升。

6.确定最适PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。

7.对于基线阈值(threshold)和阈值循环数(Ct)确定的研究资料。

8.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。

另外,对于试剂盒的内标、定标品、对照(质控)品设置,建议企业参考以下要求执行:

(1)乙肝病毒核酸定量检测试剂盒的外部对照(质控)品应至少设置三个量级水平的系列定标品:临界阳性对照(质控)品、强阳性对照(质控)品和阴性对照(质控)品,定标品和质控品均应参与样本核酸的平行提取,以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企业应对各种对照(质控)品的Ct值做出明确的范围要求。注意,建议采用与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液作为阴性对照(质控)品,不推荐采用水作为阴性对照(质控)品。

(2)样本反应管应设置合理的内对照(内标)以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质控。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证,既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线但又不能对目的基因的检测造成竞争性抑制而导致假阴性。对内标的Ct值也应有明确的范围要求。

(七)分析性能评估资料

企业应提交原厂在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料,对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现,包括实验地点(实验室)、适用仪器、临床样本来源等。分析性能评价的实验方法可以参考相关的CLSI-EP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。对于乙肝病毒核酸定量类检测试剂,建议着重对以下分析性能进行研究。

1、乙肝病毒核酸(DNA)提取

病毒DNA提取主要有以下目的:富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物,是决定PCR成败的关键环节。因此,无论申报产品是否含有DNA分离/纯化的组分,企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物,因此,对于DNA提取试剂的选择,除最大量分离出目的DNA外,还应有纯化步骤,尽可能去除PCR抑制物。常见的DNA分离纯化方法(如酚抽提法、甲酰胺解聚法等)和改良方法各有优势和不足,申请人应结合申报产品的特性,合理选择DNA分离/纯化试剂,并提供详细的验证资料(提取效率、与后续试验的配合等)。

2、最低检测限(分析灵敏度)

(1)最低检测限与定量限的确定

建议使用国际标准品/国家标准品进行最低检测限确定,使用多份标准品制备梯度病毒稀释液、每个梯度的病毒稀释液重复适当次数(4次),将具有95%以上阳性检出率的病毒水平作为最低检测限。建议最低检测限应≤30IU/mL。

定量限应高于或等于检测限,将多次(至少10次)测量的计算误差符合试剂准确度研究规定的误差要求的最低病毒水平作为最低定量限。

(2)最低检测限和定量限的验证

申报试剂应在最低检测限或接近最低检测限的病毒浓度对国内常见(至少包括B、C、D型)基因型进行验证,总测试数不少于60次。定量限的验证应对国内常见(至少包括B、C、D型)基因型进行验证,总测试数不少于40次。

对此,企业应能够提供用于最低检出限/定量限验证的各个病毒株的来源、型别确认及滴度确认试验等信息。

线性范围确定的研究应使用高值临床样本(由可溯源至国家标准品/国际标准品的方法定量)进行梯度稀释,稀释剂应使用经确认为阴性的混合人血清或血浆,应包含9-13个浓度(应包含接近最低检测限的临界值浓度),使用至少3个批次的试剂进行试验。通过评价一定范围内的线性关系及各水平的准确度确定该方法的线性范围。

    对测量准确度的评价依次包括:与国家标准品(和/或国际标准品)的偏差分析、回收实验、方法学比对等方法,企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。
    该检测有相应国家(国际)标准品,使用国家(国际)标准品进行验证,重点观察对相应标准品检测结果的偏差情况。
    (2) 回收试验。用于评估定量检测方法准确测定加入纯分析物的能力,结果用回收率表示。通常对样本进行3-5次回收试验,取平均值即平均回收率。
   ② 尽量使加入标准液后样本中的被测物浓度接近医学决定水平;
 ③标准物的浓度应该足够高,以得到不同浓度的回收样本;
  ④ 注意基质效应,尽量采用与临床待测样本接近的基质。
     采用参考方法或国内/国际普遍认为质量较好的同类试剂作为参比方法,与拟申报试剂同时检测一批病人样品,从测定结果间的相关性了解拟申报试剂与参比方法间的一致情况。如显著相关,说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符,对同一份临床样本的医学解释,拟申报试剂与参比方法相比不会产生显著差异结果。
    在实施方法学比对前,应分别对拟申报试剂和参比试剂进行初步评估,只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。

测量精密度的评价方法并无统一的标准可依,可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行,前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考相关的CLSI-EP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求,如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。

(1)对可能影响检测精密度的主要变量进行验证,除申报试剂(包括提取组分和PCR组分)本身的影响外,还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。

(2)合理的精密度评价周期,例如:为期至少20天的连续检测,每天至少由2人完成不少于2次的完整检测,从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件,申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。

(3)用于精密度评价的质控品应至少包括四个水平:

①阴性质控品:不含HBV DNA的质控品,阴性检出率应为100%(n≥20)。

②临界阳性质控品:待测物浓度略高于试剂盒的最低检测限,阳性检出率应高于95%(n≥20)。

③弱阳性质控品:待测物浓度呈弱阳性(高于定量限浓度1个数量级),阳性检出率为100%且变异系数(CV)符合标准要求(n≥20)。

④强阳性质控品:待测物浓度呈中度至强阳性,阳性检出率为100%且变异系数(CV)符合标准要求(n≥20)。

    另外,建议申请人选择适量临床采集的新鲜病人样本(包括所有样本类型)作为无定值质控品进行精密度评价,以更好地模仿临床检测环境。

6.HBV不同基因型的覆盖

应对乙肝病毒国内常见基因型(至少包括B、C、D型)进行检测,重点考察各基因型病毒样本的最低检测限、准确性及精密度指标;每个基因型的病毒样本稀释成至少3个浓度水平,对每水平样本进行重复测定。考察每种基因型样本的准确度和精密度,以评价试剂的包容性。

①用于乙肝病毒核酸检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性:核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状。(见表1)。

②建议在病毒和细菌感染的的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常,细菌感染的水平为106 cfu/ml或更高,病毒为105 pfu/ml或更高。

③申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。

1  用于交叉反应研究的微生物(推荐)

人类T细胞亲淋巴病毒Ⅰ型

人类T细胞亲淋巴病毒II型

①潜在的干扰物质主要包括:内源性物质(见表2)和常用的治疗药物如普通IFNα(2a、2b和1b)和聚乙二醇干扰素α(2a和2b)[PegIFNα(2a和2b)]、拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)、替比夫定(telbivudine)等。

②使用医学相关水平的干扰物浓度进行验证,另外,亦建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行评价。对于常见药物干扰试验,建议参照相应药物药代动力学研究确定的治疗药物浓度添加相应药物进行干扰验证,并建议添加最大治疗药物剂量做最差条件验证。

③建议在病毒的检测临界值水平对每种干扰物质的干扰影响进行检测。

2  建议用于干扰研究的物质(推荐)

*为必须验证的干扰物质。

应提交详细的溯源性研究资料。企业制备的企业标准品、二级标准品、用于制备商品化标准品的储备液以及不同基因型的阳性样本均应能够溯源至国际标准品/国家标准品。使用国家标准品/国际标准品为定标品,应用多台仪器对企业一级定标品进行定标,以下逐级对企业二级标准品、定标储备液、阳性参考品(质控)进行定标。

对于适用多个机型的产品,应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。

(八)参考值(范围)确定资料

对于此类试剂,正常人群中不应检出HBV DNA,因此不存在cut-off值或参考值范围。参考值确定资料主要是指Ct值的确认资料,建议申请人采用受试者工作特征(ROC)曲线的方式对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。

稳定性研究资料主要涉及两部分内容,申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性(有效期)、高温加速破坏稳定性、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究,申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究,应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

应对样本稳定性进行研究,主要包括室温保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证,可以在合理的温度范围内选择3-5个温度点(应至少包括范围的上限和下限温度),每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证,从而确认不同类型样本的效期稳定性。在对样本进行效期稳定性的评价时,同时应对推荐使用的抗凝剂及采血管进行合理验证。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

对于该类试剂已有同类产品上市,按照法规要求选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂,采用拟申报产品(以下称考核试剂)与之进行对比试验研究,证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。

建议预实验选择两种参比试剂同时进行验证,考察其误差范围,选择其中一种作为正式试验的参比试剂,另一种作为第三方验证试剂。选择的参比试剂样本类型及检测范围应能够涵盖考核试剂的相关样本及检测性能,以免造成考核试剂部分性能无法验证的情况。

对比试验结果不一致(包括是否检出及检测值差异较大的)的样本应采用公认较好的第三方试剂进行验证。

2. 临床研究单位的选择

建议申请人在选择临床单位时,应考虑到各试验单位之间的平行性和一定的地域代表性;临床研究单位应具有分子生物学方法检测的优势,实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节(仪器、试剂、质控及操作程序等),熟悉评价方案。在整个实验中,考核试剂和参比方法都应处于有效的质量控制下,最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。

临床试验实施前,研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑,设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致,且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施,不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成,申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外,不得随意干涉实验进程,尤其是数据收集过程。

试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准,任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的参比试剂应一致,以便进行合理的统计学分析。同时方案中应明确确证试剂及方法。

4.病例选择及样本类型

临床试验应至少进行500例病例的试验,其中应主要选择乙型肝炎患者(阳性样本),在病例选择时应考虑到地域性的差别,应涵盖不少于10例常见的D基因型,应注重不同药物治疗的乙肝病人。阳性样本应覆盖试剂线性范围,均匀分布高、中、低值。建议选择不多于50例的HBV阴性样本进行比对试验,阴性样本不应全部采用健康人群样本,而应考虑可能存在交叉反应相关的病例如丙型肝炎等其他肝炎病毒感染病例及其他良性或恶性肝脏疾病患者,以从临床角度考察其分析特异性。

临床试验中所涉及的样本类型应为实际临床检测中常用的样本类型。对于同时能够检测血清和血浆样本的试剂,应至少进行50例在同一HBV患者分别采集的血清和血浆样本进行比对试验研究,阳性样本应包括强、中、弱阳性及部分阴性样本。

临床样本应以新鲜样本为主,如采用库存样本应另行说明 。

对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法,对于本类产品对比实验的等效性研究,常用相关性、线性回归对log10滴度结果进行统计分析,考察两组数据之间是否存在相关性。常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果,对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性,统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设,即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。

6. 结果差异样本的验证

在数据收集过程中,对于两种试剂的检测结果有不一致的样本,应采用临床上公认较好的第三种同类试剂进行验证试验,同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

7. 临床试验总结报告撰写

根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求,临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述,应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述,并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。

(1)临床试验总体设计及方案描述

① 临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。

② 病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准。

③ 样本类型,样本的收集、处理及保存等。

④ 统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。

(2) 具体的临床试验情况

① 申报试剂和参比试剂的名称、批号、有效期及所用机型等信息。

② 对各研究单位的病例数、年龄分布情况进行总合,建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。

③ 质量控制,试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况,对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。

④ 具体试验过程,样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。

① 数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。

② 两组数据结果的相关性、线性回归的结果。

③对相关性及线性方程的显著性检验,验证两种试剂定量结果的一致性。

④阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%(或99%)的置信区间。

⑤以交叉表的形式总结两种试剂的定性检测结果,对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。

另外考虑到对不同样本类型的检测结果可能存在一定差异,故建议对不同样本类型分别进行统计分析, 以对考核试剂的临床性能进行综合分析。

对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果,对本次临床研究有无特别说明,最后得出临床试验结论。

1.分析特异性(analytical Specificity):测量程序只测量被测量物的能力。分析特异性用于描述检测程序在样本中有其它物质存在时只测量被测量物的能力。通常以一个被评估的潜在干扰物清单来描述,并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度。 

注:潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物。 

2.精密度(precision):在规定条件下,相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示,如标准差(SD)和变异系数(CV)。

1. 《体外诊断试剂注册管理办法(试行)》,(国食药监械[号),2007年4月19日。

2. 《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》,(国食药监械[号),2007年4月28日。

3. 《体外诊断试剂说明书编写指导原则》,(国食药监械[号),2007年4月28日。

4. 李金明,《实时荧光PCR技术》,第一版,人民军医出版社,2007。

5. 《中国生物制品规程》(2000年版),化学工业出版社。

6. 庄辉 ,乙型肝炎流行病学研究进展,中国医学前沿杂志2009年第1卷第2期。

8. 黄留玉,《PCR最新技术原理、方法及应用》,化学工业出版社。

9. 樊绮诗,吕建新,《分子生物学检验技术》,人民卫生出版社。

一、医院药学常用仪器设备的配备

现代医院管理学将医疗设备分为诊断设备、治疗设备和辅助设备三大类,每类又分8-10小类。医院药学的仪器设备主要包括在诊断设备类的实验室诊断设备中和辅助设备的制药机械设备、医用数据出现现代医学科学的重点。近年来随着医院临床药学和药物研究工作的深入开展,现代化的药学仪器设备不断涌入了医院,医院药学仪器设备的科学化管理已成为刻不容缓的任务。现代医院药学的仪器设备至少分为制剂仪器设备类,包括药物提取,加工各种制剂的设备;药品检验仪器设备,包括常用的天平、电冰箱、恒温箱等基本设备和光分析设备等;临床药学仪器设备,主要包括用于血药浓度监测的贵重分析仪器,如高效液相色谱仪、荣耀分光光度计等;药学管理设备,主要是电子计算机和相应药学管理的数据库。现将现代医院药学应配备的常用仪器设备的名称、特点和主要用途作一扼要说明。

医院药物制剂常用粉碎、过筛、蒸馏、蒸发、加热干燥和冷却等设备,主要用于药物的加工和各种制剂的制备。

(1)截切机:由输送器和切刀组成,适于茎、叶和韧性要挟药材的截切。

(2)截切粉碎机:与万能粉碎机相似,转子和粉碎室中均装有网刀,适于韧性和纤维性药材的粉碎。

(3)研钵:有瓷制、下班制和玛瑙制几种,适于少量药物的粉碎。

(4)铁研船:有手推、足蹬和电动三种,适于质地松脆、吸湿性小,不与铁起反应药物的粉碎。

(5)胶体磨:由上下磨器组成,配以精密控制粉碎面装置的特种靡,可得直径1μm以下的微粒,常用于制备混悬液和乳浊液。

(6)电动冲钵:为间歇性粉碎工具,适于含挥发油和易粘结成块药物的粉碎。

(7)球磨机:由不锈钢或瓷制圆筒,内装一定数量和大小的圆形钢球或瓷球构成,适用于结晶性、脆性药物及非组织性中药的粉碎。亦可用于区菌药物的粉碎的混合。

(8)万能粉碎机:粉碎室中转子和盖上都装有若干相互交叉排列的钢齿,药物被避剧烈转动的钢齿撕裂、襞裂和研磨,在气流作用下经环状筛板分离出细粉,适于粉碎各种干燥非组织药物、植物的要茎皮等。此类粉碎机尚有旋钟式和打板式的

(9)流磨机:系用高速弹性气体(空气、蒸气式惰性气体)使药物颗粒相互碰撞而产生剧烈的粉碎作用,经分级器可分出5μm以下的极细粉。适用于抗生素、酶、低溶点和其它热敏性药的的粉碎。

(10)滚压机:由两个沿水平轴以相对方向旋转的滚筒组成,适于脆性药物的粗粉碎。

(1)手摇筛:筛网由铜丝、铁丝、不锈钢丝、绢、麻和尼龙丝编织成,固定于竹、木、金属圈上制成圆形或长方形。主要用于小量、毒剧、刺激性性质轻药粉的筛析。

(2)悬挂式偏重筛粉机:利用偏重轮的转动而产生振动,筛同的毛刷随时将药粉刷过筛网。适用于矿物药、化学药及显著粘性药材粉末的过筛。

(3)振动筛粉机:利用偏心轮对其连杆产生入复振动筛析药粉。适于无粘性植物药和化学药筛析。

(4)电磁簸动筛粉机:振动幅小(3mm内),频率高(每分钟200次以上),有较强的振动荡性。适于粘性较强药粉的过筛。

3.混合器械有混合筒、槽形混合机的双螺旋锥形混合机,用于两种以上药物或赋形剂的混合。

4.滤材有多孔滤板,常用垂溶玻璃漏斗、滤球、滤棒等,近年有微孔滤膜系高分子多孔性薄滤材。用于阻留液体中固体性物质。

5.蒸馏设备有小型常压蒸馏装置、小型减压蒸馏装置和水蒸汽蒸馏装置,常用于药物的精制、液体的浓缩及有机溶媒的回收等。

6.蒸馏水的蒸馏设备常用塔式蒸馏水器、高纯度蒸馏水器和多效蒸馏水常与水质过滤器、离子交换器和电渗析器配套应用于大输液中注射用水的制备。

7.蒸发设备夹层蒸发锅和小型减压薄膜蒸发装置,用于常压或减压的药物浓缩精制。

8.干燥设备电热恒温干燥箱、喷雾干燥装置、电热真空干燥箱、红外线与远红外线干燥箱等,适用于药物的加热干燥;冷冻干燥设备适用于热敏性药物如生物制品、抗生素和一些固体注射剂的制备。

9.封闭式电冰箱用于药物的制备和某些药品的贮存,存放易燃药品则使用防爆冰箱。

10.压片机撞击式单冲压片机和旋转式多冲压片机,用于片剂的制备。

11.包衣机由包衣锅、动力部分、加热器和鼓风设备组成,用于制备糖衣片。

12.灌封设备手工单针灌注器和双焰溶封灯用于少量小针剂的生产;大量生产可用安瓿自动灌封机;大输液大批量生产可用自动灌装流水线设备。

(二)药品检验仪器设备类

医院的药检主要是对自制制剂和其半成品进行鉴别、检查和含量测定,对购入的、库存的或质量可疑的药品原料或成品进行检测,一般以快速检测为主。因此,齐全、先进的仪器设备不仅能保证医院药品质量监督的实施,同时也反映出医院药学工作的水平,特别近几年临床药学工作中血药浓监测的开展,促进了药检工作现代化仪器齐备配置的步伐。

1.常用玻璃仪器中主要有容量玻璃仪器如量瓶、吸理管、滴定管、量筒等;一般玻璃仪器有分液漏斗、称量瓶、碘量瓶等。

2.分析天平TG328A型电光分析天平,最大称量200g,分值0.1mg,机械加码范围10-199.9g,光学读数全量值10mg ,光学读数最小刻度值0.1mg ,系万分之一分析天平,最大称量20g ,分度值0.01mg,机械加码范围1-99mg,光学读数范围0.01-1mg,光学直读数0.01mg.。

3.旋光计是用来测定物质旋光度的仪器。含有不对称碳原子的化合物液体或溶液,均有一定的旋光度,物质的旋光度又因测定时的温度、光源、溶剂、浓度及杂质含量不同而变化,故可利用旋光度业检查物质的纯度或测定药物在溶液中的浓度。

(1)目测式旋光计:国产WXG圆盘旋光计,最小读数为0.05°,精度较差,可作为半成品检查。Zeiss Windel类(原西德)、Shimadzu类(日本)目测旋光计精确度可达0.01°。

(2)WXG和WZZ-2等自动指示旋光计。

电位法测定pH值系利用电极在不同溶液中所产生的电位来确定其pH值。淀时将指示电极和参比极组成一电池浸入溶液中,其产生的电动势力与溶液的pH值有关,参比电极的电位保持恒定,指示电极的电位随溶液的pH变化而改变,利用直读法或补偿法溶液的pH值。常用的参比电极为饱和甘汞电极,常用的指示电极为玻璃电极。它可有用于有色、胶体、粘体、粘稠或混浊液及半固体物质等的pH值测定和pH滴定,酸度计还可用用测定电动势和用于电位滴定。常用酸度计有雷磁25型酸度计和PHS-2型酸度计。

5.折光计 物质在一定条件下,常具有一定的折光率,当混有其它物质时,其折光率亦随之改变,故可由折光率测定来鉴别不同种类的油类与检查各油类的纯度。若某物质中含有其他物质,则因所占份量不同而显示出不同的折光率,因此也可由测定折光率来计算某些溶液的浓度。

6.可见分光光度计 可用于有色溶液和可显物物的分光光度测定。常用仪器有72型、721型、722型、XG-125型、7211型,均为国产。

7.单波长单光束紫外一可见分光光度计 常用仪器中有手动式的国产751型、751G型、7520型、722型、WFZ80-D2型、752型、753型、英国SP-500型、日本QV-50型;具微机数据处理功能式的有国产WFZ800-D3型、53WB型、752GW型、752C型,美国DU-8型。

8.单波长双光束分光度计 常用仪器有国产730型、740型、日本岛津UV-200型、UV-210型,英国SP700型、SP800型。近年来,微机处理使这一类型的分光光度计功能昌趋完善,不但自动化程度提高了,而且能承担复杂的计算过程,如国产790型,美国P-E554型,P-E55XY7型,英国SP8500型、日本日立UV-340型、UV-3400型、岛津UV-240型、UV-250型、UV-260型、UV-265型、UV-356型、UV-160型、UV-2100型等。

物质分子在红外线范围的磁场中接受能量,当辐射能量(或频率)与它的各种频率(即能级)相同时,就会吸收能量而发生共振,于是就产生了分子对红外光线的选择性吸收,所以,分子吸收红外线能量是量子化的(即为不连续的),其运动能级变动和紫外吸收光谱一样,也服从于量子力学的规律。但红外线的能量比紫外线低(低动能级跃迁是电子能级跃迁所需能量的1/100-1/10),不能引起电子能级跃迁,即不产生电子吸收不谱。红外光谱是由于分子中振动的能级跃迁,并伴随分子中转动能级跃迁而产生的,所以红外光谱又称振动光谱。红外光谱分析用于鉴别化合物的类属,如有机物和无机物,芳香族和脂肪族、链状或环状构型、饱和不饱和化合物、芳香族的单核与多核,确定官能团及其人类和推测未知物的化学结构。

10.RC-3B型药物溶出仪 溶出度系指药物从片剂或胶囊等固体制剂在规定溶剂中溶出的速度和程度。凡检查溶了的制剂,不再进行崩解进限检查。

开展临床药学的重点和难点是测病人的血药浓度,没有现代化的仪器设备很难开展此项工作。近年来除了应用紫外分光光度计外,高效液相色谱仪、气相色谱仪、荧光分光光度计等正被引入医院药科学,从而促进了临床药学的深入开展。

1.荧光分光光度计 主要有光源、滤光片或单色器、检测吕器、样品池、数据处理机及显示装置等部件组成。某些物质受紫外光或可见光激发后能发出比激发光波长较长的荧光,被物质吸收的紫外光称激发光,产生的荧光称发射光。荧光光度计通过测定发射光的强度而进行定量分析。

2.原子吸收分光光度计 主要有光源、原子化器、单色器、检测器、数据处理机及显示器等部件组成。它有别于其它光光度计,光源通常用由待测元素作为阴极的空心享受极灯,原子化器由雾化器及燃烧灯头或石墨炉组成,燃烧火焰由不同类型的气体混合物产生,常用空气一乙炔火焰。适用于药品或生物样品各种元素的定量、定性分析。

本类仪器按射电磁波是连续波或脉冲波分两在类。现多用脉冲富里叶变换核磁共振波谱仪。主要有磁体(电磁铁、永磁铁、超导磁铁)、电子控制台、计算机及数年记录仪等部分组成。除另有规定者外,一般都是采用照射频率为60-100Hz,可测氢(1H)、碳(13C)、氟(19F)及磷(31P)等核的仪器。本仪器可以判定有机化合物分子中氢原子所处的位置及各种功能团和在骨架上氢原子的相对数目。用于药品的结构分析、纯度检查、分子量测定、含量测定、动力学研究等。

同流动相及贮液器、输液系统(泵)、进样系统、色谱柱、检测器及记录仪(或积分仪)等六个部分组成。其工作过程是将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等作为流动相,用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱,注入供试品,经流动相带入柱内,在填充剂上分离后,按成分先后进入检测器器,用慷仪慷色谱图。据色谱图上的峰面积(或峰向)及保留时间,进行药品和生物样品的定量、定性分析。

5.气相色谱仪 由气路系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录器、显示器及数据处理机等组成。它适用于含挥发性可经裂解、衍生等处理后能气化的药品及组分混合物的定性、定量分析

6.薄层扫描仪 (High-sped Thin-Layer ChromatoScanner,HTLCS)系指用一定波长(紫外或可见光)的光照射在薄层层析纸上,对色谱斑点进行扫描,以达到定性、定量检查样品的仪器。

7.TDx快速血药浓度检测仪 是采用荧光偏振免疫?

■[此处缺少一些内容]■

(四)药学管理仪器设备类 医院药科学的现代化管理在我国刚刚起步,其中最关键的是将计算机引进了药学管理,现要常用的计算机有IBM、286、386、486、586型,有关药学管理的软件逐渐在系统化,如药品管理系统包括药品供应、药库、麻醉药品、药检、药品质量监督管理系统和药品收发管理自动化网络系统,临床合理用药系统,药代动力学和生物剂学程序包以及药学情报资料管理系统。计算机软件在医院药学中开发、研制、应用前景十分广阔,将在医院药科学的一体化管理中发挥更大的作用。

二、医院药学仪器设备的采购

医院药学仪器设备的装备工作是医院医疗设备管理系统工程的重要组成部分。根据医院发展对药科学的要求,有计划地购置药学仪器设备,是实现医院药科学现代化的重要保证。医院学仪器设备的采购应在院长在直接领导下,由药剂科提出计划,经医疗设备管理的主管部门具体实施。作为药学工作者应该了解有关采购的药学仪器设备制定计划的原则,编制计划的程序,贵重仪器设备计划的可行性论证和采购途径等内容。

(一)药学仪器设备装备的原则

参照卫生部拟定的装备标准,在考虑药学仪器设备的装备时,应遵循经济和实用的两个原则。

1.经济原则 所谓经济原则,即按经济规律办事,讲求投资的经济效益,力求用尽可能少的费用取得尽可能大的实际效果和尽可能多的经济效益。实现经济原则的关键是实行计划管理,用计划来组织、领导、监督、调节仪器设备的。遵循有计划、按比例发展的规律和价值规律,使人力、财力、物力得到充分有效的利用。

经济原则还含有节约的意义。使现人的仪器设备要最大限度地发挥作用。加强使用管理和维修管理,尽量延长使用期限。不应脱离实际追求高自动化、电子新技术仪器设备。

应根据医院药科学的任务、规模、技术人员的技术水平和技术条件的现状,适当考虑将来的发展而确定仪器设备的装备标准。要从需要和可能出发,按照轻重缓急统筹规划,分期分批的更新设备,逐步充实配套,在有条件装备或引进设备时,则需从实际的原则出发,优先考虑基本设备,其次再考虑高、精、尖的设备,也就是先搞“常规化的武器”的现代化;在仪器设备的选择上要立足于国产仪器,首先装备国产仪器,在此基础上适当引进国外万能设备。在目前,引进设备就友提高“技术精度”的关键设备为主,不宜急于引进大型的万能设备,要充分发挥仪器设备的功能,力争投资少实用性大。

医院药学仪器设备的选择,是管理的第一个环节。传统的管理,往往从仪器设备的使用开始,而忽视闻“选择”这个重要环节。选择不当,必然造成仪器设备管理上的先天不足,则难以达到预定的目标。

1.做好预测 预测是建立在情报工作的基础上,据某种仪器设备的历史和现状的资料推测未来,或研究未来的发展状况。预测的任务就是根据目标(某仪器设备的发展规划)的要求,研究在实现这一目标过程中,如何摆脱盲止行动,指出仪器设备在不同条件下的发展结果,并尽可能提出可供选择的各种对策,通过科学方法,为制定规划方案提供依据。

规划是根据医院攻学业务技术的发展,对一个时期或一处范围的仪器设备的总体战略布局,目的保证正确的发展方向。所以规划的任务是确定适合医院经学发展的战略目标,以及实现战备目标的主要措施。医院药学仪器设备发展规划未被重视,没有列入医疗技术发展规划的组成部分,其关键在于没有规划置于战略管理的地位。系统管理的目标是提高效率,但战略管理更为重要,若方向不对,则效率越高,效果就越坏,浪费也越大。

制定仪器设备规划的主要依据是医疗技术发展规划的要求,仪器设备发展现状和自身发展的需要,以及人力、物力、财力的可能条件,使仪器设备的发展不致于超越实际的可能性。由于现代化仪器设备的发展日新月异,医疗、科研、教学等工作对仪器设备的要求也越来越高,不确定因素增多,增加了制定规划的难度,用传统的自下而上的汇总方法,已不适应制定规划的要求,应采取系统论证方法来制定仪器设备的发展规划。系统论证的要求。

(1)把规划对象作为一个有机整体,制定规划时着眼于整体效能,采取自上而下的程序。首先明确整个系统的目标和设想据此确定各分系统的目标和任务,并把各分系统和单项仪器设备的发展放到整体中去权衡,求得全面发展。

(2)形成系统论证的一般程序(步骤)

①明确规划对象、即制定何种规划。

②调查研究,收集资料。

③进行预测,提出发展方向和整体目标。

④根据整体目标,拟定各分系统目标和发展项目。

⑤对整体与分系统目标进行综合平衡、方案。

⑥提出实现规划目标的主要措施、方案。

⑦进行可行性研究,最后作出结论。

3.重视情报工作 目前有医疗单位,由于情报无人负责,信息不能及时反馈、适时调整,以致出现反复购入质量极差的产品,造成极大浪费。有产引进国外的仪器设备,困订货情报资料不明,漏汀或错汀仪器设备相应的配套附件,以致长期闲置,无法使用。另外,还有不少国外进口的仪器设备,因缺少情报资料,无法操作和维修。因此,选择仪器设备时,首先要做好情报资料工作。

仪器设备情报收集的内容主要包括两方面:一方面是要对先进技术水平的产品,要通过资料调查摸清这一领域当前的世界水平,其次了解这一产品的技术性能、同类立产品的比较参数、市场价格、运输条件、交货速度等;另一方面是指专利使用权、

技术知识使用权和商标使用权等,通过资料调查,摸清它的技术价值、主要特征及是适合我用。

查找仪器设备情报的主要途径有:国内餐期刊、文摘和索引,国内外大家样本、专利文献及索引,国内外的展览会、展销定货会、各医疗单位仪器设备动态等。

(1)依据:购置计划必须以财务预算为依据,财务预算则必须以事业计划为依据,三者必须一致,互相衔接,以免在管理上产生混乱。

(2)可能性:指购置设备的资金来源(引进设备尚须知外汇额度)是否已比落实。

(3)条件:指使用这一类设备所需的条件是否具备。要逐项考虑有无使用、安装、维修、保养的技术力量,有无房间空间。若无创造条件的具体措施,则不宜急于购置。

(4)需求评价:购置引项设备是否合理,临床需求的必要性和迫切性,有无其它可供选择的替代方法。

(5)技术评价:从设备的性能指标、技术参数方面进行技术上审查,考虑设备的行进行,可靠性和适用性。

(6)造型:选择最恰当的厂牌、型号、规格。对精度的选择,要从实际需要出发,不能盲目追求高、大、精、尖,应讲求实效。引进仪器设备注意不要引进已经或将要淘汰的设备,注意试剂、消耗材料及零配件的补充,注意主机和标准件是否完整。

(7)维修性:选择设备时,要考虑设备维修和修理工作量及费用。对于设备本身是否易于拆卸修理,供方提供维修服务和有关资料、技术、零配件的可能性和持续时间均应考虑。

(三)仪器设备计划的编制

仪器设备计划应在任务明确,方案经充分论证后再编制,使计划与任务一致,需要与可能一致。

1.仪器设备计划的类别和编制要求

(1)进口仪器设备计划:在外汇指标许可范围内和国内人民币落实的前提下,可申请向国外订购,按年度编报进口计划,于每年8月底提出下年度计划,按各单位归品上报编报计划应填写“订货卡片”、“订货卡片说明”。订货卡片上所列各项均应认真填写,字迹清晰,英文最好打字并留行距。对规格、型号、技术要求、国别厂名行等,填写后要核对。附件、备用均要列出清单,填不下可另附表。单价和金额应尽量估计准确,最好以国外厂商的报价单作参考。用途指仪器设备本身的用途。用于教学、科研订货。可申请免税,订货卡填妥扣要另盖公章。

(2)贵重仪器设备计划:一定限额以上的国产仪器设备,需于每年8月底前编报下年度计划。属于国家计划分配品种按归口上报,通过订货解决,其它经市场采购解决。

(3)专题计划:为完成重点任务或科研课题需要,便于仪器设备配套和同步解决,可编报专题计划,要求以级专题解决,同量要组织学专门人员落实。

(4)临时计划:为适用临时医疗任务或科研项目需要,可提出临时需要的仪器设备计划。

(5)不宜编制计划的情况:资金无来源,规格型号和技术性能不清,使用率不高,产品落后,安装条件、仪器操作和维修力量未落实。

2.大型仪器设备计划的技术咨询

仪器设备计划编制是否科学、合理,要注重发挥专家内行的作用,广泛进行技术咨询。对于大型仪器设备,应邀请行家对选购计划进行技术论证,提出咨询意见,为领导决策提供选择方案。

3.仪器设备计划的审核

主要从三方面进行审核:需要性审核,计划的必要性、迫切性、合理性;技术性审核,型号、规格、性能和指标等;行政性审核,经费的可能性及协作合办、人员配备等。经医疗设备管理委员会审后报主管领导批准。

实施仪器设备计划主要有两个途径,一是通过计划分配(订货),一是通过市场调节(采购)。计划分配是使用部门通过计划提出申请,由国家物资管理部门进行综合平衡,分配指标,采取订货或国家物资供应网点等方式组织供应。市场供应一般采取计划申请,核实供应和敞开供应。市场采购方式有会议订货、委托采购、函购、就地采购到产地采购等。

(1)国外订货:申请进口仪器设备或零配件,均需按进出口公司或有关部门规定,首先填报体贴卡片,经主管部门审批同意扣,由各进出口公司统一对外联系订货,及时将与外商联系的情况告知订货单位。当接到进出口公司征询单时(国外报价单、产品规格型号和技术性能等意见),要及时组织有关人员认真研究,立即给予答复,不要超过期限。发报价超过原俣价额,应及时按类务归口渠道办理外汇手续。当接到国外合同时,要逐项仔细核对,无误时立卷、保存,并提前做好接收仪器设备的准备。

(2)国内订货:申请国内计划分配的仪器设备,应按上级要求和下达的指标参加订货会议,签订供货合同(协议)。参加订货的人员必须熟悉订货计划,确保产口质量。在签订合同时,对所订仪器设备的品名、规格、型号、技术指标、质量要求、订华数量、价格、交货日期、交货地点、方法、验收条件、付款方式等项目都要有明确要求,以条款方式下来,经双方确认盖章生效。订货合同具有法律效力,违约者要承担法律责任放经济损失。订货合同落实后,要做好接货准备。

(3)招标:是一种有效的方法。随着国际效的增加,采取招标方式采购仪器设备,可以合理的低价买到适合使用要求的优质设备,对有效利用资金引进先进设备和先进技术,有一定的积极作用。

(1)常规采购:采购包括本地采购和外地采购,应以本地采购为主。采购人员要熟悉市场货源情况,积极疏通业务渠道,组织来货源。特殊要求的仪器和零配件条积极联系加工订购。对市场短缺品种,要及时与有关方面联系协商解决办法和完成途径,对未落实品种,要及时给申请者回复。

(2)函购:凡能函购解决的问题,尽量不派人外出采购。函购能节省人力物力,增加供应渠道。

三、医院药学仪器设备的使用规范

医院药学仪器使用管理的任务有两个方面:一是保证仪器设备的安全,包括数量上的准确性和质量卢的完好性,以便完整地保持其使用价值;二是提高仪器设备的使用率,充分发挥其医疗效益,追求更多的社会效益和经济效益。仪器设备使用的规范化管理涉及管理思想、制度建设、财产帐目、技术档案建立、使用率调查以及教育培训等六方面问题。管理思想方面要求充分调动使用人中的积极性,增强责任房,爱护公共财物,把设备管好用好;提倡专管共享,协作共享,提高使用率。制度建设方面应健全。到货、验货、仓储、分配发放,在用设备管理(包括技术档案、操作规程、调配、组织共用)、献策产清点、退库利用及调剂处理、报废等一系列规章制度,力必使财产帐目健全、帐帐相符、帐实相符。技术档案方面,对贵重精密仪器设备建立技术档案。贵重精密仪器设备的划分可采用价格与精密度相结合的方法,一般指价值1万元以上的仪器,也可在5000元以上的仪器,或价值虽不足规定金额,但其精密度甚高,应特别注意保养的,亦可划入贵重精密仪器齐备。

(一)医院药学贵重仪器设备的使用要求有三方面

1.贵重仪器设备的要求:

(1)有专人保管(应熟悉该仪器设备的性能、使用等)。大型精密仪器设备应有专人使用。

(2)设立技术档案(包括订货合同、说明书、验收记录、主件及附件清单、登记卡片、操作规程、保养和维修记录等)。

(3)有使用记录和性能动态记录。

2.贵重仪器设备使用操作人中职责:

(1)严格遵守操作规程和仪器管理规定。

(2)爱护仪器设备,责任心强。

(3)技术操作熟练,经考核合格。

3.贵重仪器设备使用保管人中职责:

(1)保持仪器设备随时处于完好状态,经常检查、保养,及时维修。

(2)检查使用登记情况,发现问题,及量报告解决。

(3)保存技术档案,更换保管人员时,交待手续清楚。

(4)补充零配件及消耗品。

(二)仪器设备的使用管理方法,一般均以帐卡、档案、制度、规定为管理的主要方法。

1.建立仪器设备管理帐以“仪器设备管理卡片”为记帐凭证,做为仪器设备管理和清查时依据,是各种仪器设备各种数据统计的原始资料,但不作为财务结算和物资发放的依据。

2.建立仪器设备管理卡,仪器出库时填写管理卡,并由使用单位人要卡片上任免盖章。管理卡片一式三份,器械科存一份作为管理帐,使用单位二份,一份由使用单位保存,作为清点和管理仪器设备的依据,一份随仪器设备存放在技术档案内。

3.建立技术档案,包括订货合同,发标提货单据,出入库凭证副联,验收记录,产品样本说明书,线路图,安装及运转技术要求,安装调试记录,试验报告,使用操作登记,操作规程,检验记录,维修保养记录,损坏报告及原因分析,零件耗损及补充记录吧及其他有关的一切技术资料。目前多数单位建立精密仪器设备履历书,作为技术档案的主要内容,其优点是便于保存和查阅。技术档案应按统一建立,并设专人专职或兼职管理。原始资料的正本存于技术档案里,仪器设备说明书、线路图等复印件一份随仪器设备存放于使用单位处,对贵重精密仪器可设“精密仪器使用设备维修记录簿”,由保养人负责管理,每次使用后,要逐项登记日期,使用时数,使用人等,使用人签名后由保养人验收签字。每将近更换新册时,应将旧册存入技术档案。

4.建立相应的仪器设备使用管理的制度的规定:

(1)计划编审与审批制度;

(2)采购验收及仓库管理制度;

(3)设备技术档案制度;

(4)仪器性能精确度鉴定制度;

(5)仪器使用操作规程;

(6)设备作用、维修、保养制度;

(7)设备使用人员考核制度;

(8)设备的领发、破损、报废、赔偿制度;

(9)仪器设备使用安全制度。

如果这些制度订的严密合理,岗位责任制明确,并严格执行,仪器设备管理工作流程必然处于一个良好的状态。在仪器设备使用率方面,应克服盲目引进和本位主义,提倡仪器齐备专管共用,协作共用或多机联用,以提高仪器设备的利用率。采用多种形式培训设备管理人中和使用人员。以提高仪器设备使用管理的水平。药学仪器设备规范化使用,要求使用人工员具有一定的学识水平,经过专门训练,熟悉仪器设备的性能,并严格按操作规程使用。下面对医院药学常用仪器设备的使用方法作简单介绍,有引起仪器设备需按说明书操作。

1.各种粉碎机械的性能与特点各不相同,应依其性能结合被粉碎药物的物质及要求的粉碎度合理选用。

2.高速运转的粉碎机开动后,待其转速稳定量再加药,否则因药物先进入粉碎室,机器难以启动,引起发热,甚至会烧坏电动机。

3.药物中不应夹杂硬物,以免卡塞,引起机发 热或烧坏。如铁钉等进入粉碎室,长时间磨擦可引起燃烧,在加料总动员人壁附上电磁铁装置可以克服之。

4.各种传动机构如轴承、伞形齿轮等,必须保持良好的润滑性,以保证机件正常运转。

5.电动机及传动构应用防护罩罩好,以保证安全,同时应注意防尘、干燥与清洁。

6.使用时不能超过电动机负荷,以免启动困难,停车或烧毁。

7.电源必须符合电动机的要求,使用前应注意检查,一切电气设备都应装接地线,确保安全。

8.各种粉碎机在使用后均应检查机件,清洁内外各部,添加润滑油后罩好,必要时予以检修。

1.根据对粉末细度的要求,选用适宜号数的药筛。

2.筛内药粉不宜过多,一般为药筛容积的1/4为宜。

3.较大粉粒有能通过筛孔时,应取出重新粉碎,不可用于挤压,以防不适宜的大颗粒通过,或因压力过大而损坏筛网。

4.药粉中含水分较高时,应充分干燥后再过筛;易吸温性药粉,应在干燥条件下过筛,含油脂多的药粉,易粘团成块,可于脱脂后过筛。

5.操作时,应注意防尘,毒剧药及刺激性较强药物过筛时,应在密闭装置中进行,并庆做好完全防护。

6.药筛用完后,应用软乞求刷刷净,必要时用水冲洗,但应及时晾干。

(三)减压蒸馏装置的使用

1.减压蒸馏应选用壁厚耐压的圆底或梨形仪器,禁用平底仪器,以防在受压力不均而引起爆炸,连接处亦需利用耐压像皮管。

2.仪器安装好后,需检查严密情况和所有达到的严密情况。为此,关闭安全瓶活塞,开动减压泵。若压力降不下,则应检查仪器各处连接是否严密,必要时适当调整。从压力计上观察仪器所能达到的减压程度。

3.检查完毕,慢慢打开安全瓶活塞,使与大气相通,然后关闭减压泵,停止抽气。

4.将欲蒸馏的液化倒入蒸馏瓶中,液体量约为其容积的1/2,不可过多。关闭活塞,开动减压泵。

5.达到所需真空度后,将蒸馏瓶浸入热浴,加热蒸馏瓶的球形部分占其体积的2/3,不要触及热浴底。逐渐升温,热浴温度要比蒸馏液的温度出20℃左右。调节进入毛细管的空气量,使液体保持平衡沸腾。

6.在蒸馏过程中要注意观察,记录时间、压力、沸点、热浴温度及镏出液体的速度等。

7.蒸馏完毕,按下列步骤结束操作:先停止加热,移去热源,让蒸馏瓶自然降温一段时间,再慢慢打开螺旋夹及安全瓶活塞,放入空气。当系统内外压力平衡后,关闭减压泵,停止抽气。拆除仪器时先取下接受器,再取蒸馏瓶。

使用时应按要求操作,调节好蒸汽与冷却水的质量和数量。蒸馏水器要定时拆洗,将内壁附着的锅垢除去,注意不能擦破表面镀层。蒸馏水器使用完毕,应趁热将锅内余水放尽,下次使用前再放入蒸馏水,以免盐类及垢物沉积而不宜清洗。

(五)电热恒湿干燥箱的使用

1.使用前应检查温度调节器的性能是否良好,然后根据干燥物质及干燥目的调整至所需温度。

2.干燥时,应打开排气孔,以便箱内水分逸出。有鼓风装置的箱,在加热和发行量温过程中必须开启鼓风机,否则会影响箱内温度的均匀性和损坏的物品。

3.箱内干燥物不可过多过挤,散热板上不应放物品,以免影响热气流的上升。

4.凡能产生腐蚀性及其它有害气体的药材忌用干燥干燥。干燥物含挥发性物质时,应物在空气中挥发后再放入箱内干燥。

5.干燥玻璃皿时,应待其温度降至接近温时再取出,以防止炸破。

6.干燥温度切忌超过被干燥物的熔点。

7.需要观察箱内的物品时,可开启外道箱门,透过玻璃门观察。但以尽量少开为宜,以免影响恒温。特别是箱内温度在200℃以上时,玻璃门因温度骤降而易破裂。

8.用毕,有关开关和旋钮应置于零点或关闭,并切断电源。

1.电冰箱应放在通风干燥处,不得靠近发热体如暖气、烘箱等,并避免阳光直射。

2.冰箱底部应垫10cm高的木架,箱后高墙应在15cm以上,以利空气对流和散热。开门的时间要短,次数要少,以保持箱内温度稳定,延长使用寿命。

3.保持箱内清洁,不得贮放有腐蚀性、易燃性和易爆性物品(如强酸、强碱、乙醚、丙酮等),以防其蒸汽腐蚀或发生为灾。存放热物品时,应待物品冷至室温后再放入。

4.当蒸发器上结冰太厚(5-10mm ),应融化冰层并清洗冰箱内壁,以免影响机器效能,融冰时,可将温度控制器械上调节钮拧到“融冰”外,或将带有半自动化霜装置的温度控制器“化霜”揿扭按一下,使机械停下,蒸发器上的结冰即会自然融化。待冰霜融化,再调节旋钮至原位,使之重新工作。融冰时,禁用硬物敲击冰层,或用锐器铲除冰霜,以免损坏蒸发器。

5.电源电压不能低于额定电压15%或高于5%,否则机械不能正常运转或造成电机烧坏接电源时,要接在主电路上,箱壳要接地线,以防电路漏电,造成触电事故。

6.根据箱外气温和贮存量的变化,注意调节温度控制旋钮,使箱内温度恒定在4-6℃。

7.当冰箱发生特异响声时,应及时检查一维修。

1.使用前检查天平各零部件是否完好无损,刀垫是否在支架的正确位置,并用软毛刷拭天平盘。

2.检查天平是否放在水平位置,如不符合,可以调整垫脚使其保持水平位置核查供电电源与仪器所标注的电压相符合所接通电源。

3.轻轻开戾升降钮,使天平梁落下,观察指针或光幕上“0”刻度线是否指在零点附近,若偏离零点太远可用调节天平臂上的零点螺丝进行调节;若偏离较小可用底座下面光幕调节杆(钮)调节。

4.使用天平时,最好将称物在普通天平上称得近似重量后,再用带橡皮套的镊子将被称物体置一器皿或衬一隔膜放天平承物盘内,进行精密称定。

6.观察天平平衡点时,应在天平门完全关闭后读取,并连续读取2-23次。

7.天平不得超负荷使用。

8.称重时砝运到应顺序取用,最重的砝码应放在天平盘中心。

9.加砝码试重时,应由大至小依次增减砝码,轻慢地旋转升降旋钮,发现指针偏斜很快时,应立即关闭升降旋钮,再酌量加减砝码。

10.挥发性的吸湿性物质应置密闭容器内称重,酸、碱等腐蚀性物质应绝对避免附着天平盘上。

11.加热物质称重时,应放冷至室温再进行称量。

12.分析同一检品,若需数次称量,则应使用同一架天平和同一组砝码,以减少误差。

13.称量完毕立即将重量记下,应先查砝码盒内空位,记下重量,然后以先大后小次序取下砝码放入砝码盒中,并作一次核对,称完后,应将被称物立即取出。

14.称量过程中如发现称量可疑,或连续称量次数较多,应随时检查平衡点有无变动。

15.称量完毕,必须检查升降旋钮是否关闭,被称物体和砝码是否取下,自动加砝码的天平要检查刻度盘是否指在零上,然后关闭天平门,切断电源,罩好天平套。

(八)WXG自动指示旋光计的作用

1.按仪器标注的电压接通电源开关,经5-10分钟钠光灯发光稳定后开始测定。

2.将滤色镜片置于样品室左端槽里,将装有蒸馏水的测定管放入样品室,盖上箱盖。

(1)测定管中若有气泡,应先使气泡浮在凸颈处。

(2)测定管两端扩片的雾状物及水滴,应用软布擦干。

(3)测定管两端螺丝帽不宜旋得过紧,以免产生应力,影响读数。

(4)测定管安装时应注意位置和方向,以保证每次测定的一致性和准确性。

3.打开示数开关,调节零位手轮,使旋光示值为零。

4.关闭示数开关,取出测定管,弃蒸馏水,用待测溶液荡洗3次,将待测溶液装入测定管中,按相同的位置和方法放入样品室内,盖好箱盖。

5.打开示数开关,示数盘即能自动给出该样品的旋光度。示数盘上红色示值为左旋,用(-)表示;黑色示值为右旋,用(+)表示。目前较先进型号的旋光度由电子管或液晶显示,或打印记录但操作方法基本一致。

6.逐渐按下复测旋钮,重复3次读数,取平均值为测定值。

7.使用完毕后,关闭电钮,断绝电源,并将测定管立即用水洗净,晾干。

(九)雷磁25型酸度计的使用

1.装置电极 仪器配用221型玻璃电极和22型甘汞电极,玻璃电极的塑料帽夹在小夹子上,玻璃电极导线的插头全部手插在插孔内,甘示电极的金属帽夹在电极夹大夹子上,电极的高度可以利用电极夹上的支头螺丝任意调节。

(1)置pH-MV于“pH”位置。

(2)将适量缓冲溶液注入试杯,将电极放入溶液中,使玻璃电极之玻璃球及参比电极之毛细管全部浸入溶液,轻轻摇动试杯,使之均匀。

(3)将浓度补偿器尖头旋钮指于溶液相同之温度。

(4)根据缓冲溶液的pH值,置量程选择开关于pH范围“0-7”或“7-14”。

(5)调节零点调节器使指针指于pH7。

(6)按下读数开关,使电极接入仪器,如要揿住读数开关,按下后向右旋动少许即可,然后调节定位调节器,使指针指示标准溶液的pH值。

(7)放开读数开关,指针应在pH7外,如有变动,应调节零点调节器,并重复6、7之操作。

(8)校正至此结束,以蒸馏水冲洗电极与试杯,校正后勿再旋动“定位调节器”,否则必须重新校正。

(1)用滤纸轻轻地将附在电极上的剩余溶液嘛干,或用被测溶液洗涤电极,然后将电极浸入被测溶液中轻轻摇动杯使溶液均匀。

(2)被测溶液之温度需与标准缓冲液相同,否则需调节“温度补偿器”至被测液之温度。

(3)指针在放开揿开关后必须指于“pH7”处,否则应调节零点调节器至“pH7”处。

(4)按下读数开关,指针所指之值即为该溶液的pH值。

(5)若指针读数超出刻度范围“0-7”标度尺之左端,可将量程选择开关置于“7-14”的位置,然后重复(3)与(4)的操作。

(6)测量完毕,放开读数开关,冲洗电极。

4.电动势的测定 将pH-MV开关置于所需+MV或-MV处,温度补偿器和定位器不起作用,调零时指针应调至0MV处,其它操作同上,即可进行电位测定和电位滴定。

1.将折光计安置于充分光线的平台上(但不可受日光直射),并装上温度计,必要时可连接恒温器,以保持一定温度。

2.使棱镜透光后朝光源,将镜筒拉向观察者,使成一适当倾斜度。

3.对疹反光镜,使视野内光线最明亮。若在傍晚或光线不足室内,或测定色泽深的检品,可将棱镜上的圆窗打开,以增加光线强度。

4.将下棱镜拉开,用玻璃或吸管取检品少许(1-2滴)滴在镜面上,然后将上下两块材镜合拢、扣紧。

5.旋转刻度尺旋钮,使读数在检品折光率附近,然后放置补偿器旋钮使视野内明暗分界恰位于十字交叉点,如此反复操作三次,取三次读数的平均值。

6.打开读数筒小反光镜,适当采光,记下刻度尺的读数及温度,即为该温度时检品的折光率,左则系含蔗糖百分率读数,右则为折光率读数。

7.测定完毕,如检品为水溶液,应随即用脱脂棉吸去检液滴蒸馏水干标棱镜上,再用脱脂棉吸干,反复洗涤3次,最扣用拭镜纸或脱脂棉轻轻揩拭干净。如检品为油类物质,应随即用蘸有二甲苯或乙醚的脱脂棉将棱镜按上法揩拭干净。

(十一)72型光电分光光度计的使用

1.检查供电电源与仪器所标注的电压的否符合,插上电源。

2.把单位光器的光路闸门板到黑点位置,将微电计电源开关旋到“开”处,此时指方向调节光点即出现在标尺上。用零点调节器将指示光点调于透光率标尺“0”位上。

3.启开稳压器的电源开关和单色光器的光源开关,把光路闸门扳到经点,再按顺时针方向调节光量调节器至光门适当开启,使微电计的指示光点达到标尺的上限附近,隔10分钟,待硒光电池趋向后,再开始使用仪器。

4.将单色光器上的光路闸门重新扳到“黑”点处,再一次校正微电计指示光点于“0”位,开启光路闸门。

5.打开吸收池暗箱盖,取出吸收池架,将一只吸收池内装入空白溶液或蒸馏水,其余3只装入待测溶液。把已放有吸收池的吸收池架重新置于暗箱内定位装置上,盖好暗箱盖。装空白溶液的吸收池应放在吸收池架的第一个格。以便操作。

6.用波长调节器把所需的波长调节至对准红线(此时盛空白液的吸收池正在光路上),按顺时针方向轻轻旋动光量调节器,把指示光点调于透光率100的读数上。

7.将吸收池定位背装置拉杆拉出第一格,使第一个未知浓度的溶液进入光路,此时微电计标尺上所指的读数即为该溶液的吸收度及透光率。再依次将第二及第三个未知浓度的溶液推入光路内。读取其吸收率和透光率。

8.在未各有浓度溶液测定前,应先配一系列浓度的标准溶液,测其吸收度,坐标纸上以浓度作横坐标,吸收度作纵坐标,绘出溶液的标准曲线。

9.使待测定溶液处在光路中,来回转动波长调节器,与透光率最低值相对应的波长(即吸收度最大的波长),即为所选择的波长。

(十二)751型分光光度计的使用

1.按仪器标注的电压接通电源,将放大器开关及钨灯(或氢弧灯)开关拨至“开”处,预热20分钟,将暗电流闸门拨至“关”的位置,选择开关扳至“校正”,波长刻度旋钮至所需要的波长上。

2.选择适当波长的光电管,手柄拉杆推入为蓝敏江电管(200-625nm),拉出即为红敏光电管(625-1000nm)。按相应的波长选择光源灯(钨灯适用于波长在320-1000nm范围内,氢弧灯适用于320dnm以下),将主机后面的反射镜手柄转向所用光源灯。根据需要还可在光路中插入一滤光片,以减少杂散光(一般情况不必要)。

3.选择适当的呼吸池,350nm以上波长可用玻璃吸收池,350nm以下的波长一定要选用石英吸收池。将待测溶液与空白溶液分别注入适当的吸收池中,放入吸收池托架内,盖好板盖。

5.向右放置灵敏度旋钮,在正常情况下,从左边停止的位置向右转3-5圈。

6.移动样品槽手柄,使标准液移至光路中,应注意使滑动板处于定位槽中。

7.将透光率旋钮旋至透光率100%。

8.将选择开关扳到“X1”上。

9.拉开暗电流闸门,使单色光进入光电管。

10.调节狭缝旋钮,使电表指针大致指在零上,然后用灵敏度旋钮细微调节,使电表指针正确指在零位。

11.拉动试样槽手柄,将样品溶液置于光路中,此时电表所指偏离零位。

12.旋转透光率旋钮,使电表指针重新移至零位。

13.待平衡后,将暗电流闸门上,以保护光电管。

14.读取透光率或相应的吸收值。当选择开关放在“X10”时,透光率范围为0-100%,相应的吸收率为∞0;当透光率小于10%时,可把选择开关放在“X0.1”的位置,此时读出的透光率数值应以10除之,或将读出的吸收度值加上1。

15.用同一空白溶液测试几个样品溶液时,只需重复(11)-(14)项操作即可。

16.仪器用毕,应依次关闭放大器械、钨灯(或氢弧灯)电源,将选择开关扳至“关”处,狭缝旋钮旋至0。01,波长旋钮至625nm处,透光率旋钮至100%。暗电流旋钮及灵敏度旋钮赂左旋到底,取出盛溶液的吸收池,用水冲洗干净,晾干备用。

(十三)红外分光光度计的使用

固体样品采用压片法或糊剂法处理,液体样品直接取一小滴,夹到样品池的两窗片之间,控制一定的厚度(一般为0.01-0.1mm)即可。

1.检查供电电源与仪器标注的电压是否相符,不符应调压,仪器中的三芯电源线必须同时使用,不可将线接错。

2.打开电源开关,预热10-15分钟。

3.装上图纸和需要的记录笔,使记录笔恰落在图线的4000cm-1线上。

4.调节时间常数开关、扫描方式开关、狭缝旋钮、100%调节旋钮及增益开关到需要的位置。

5.将标准样品聚苯乙烯蒲膜(厚度为0.05mm)置于样品架上照射,将扫描结果与标准图谱核对,用2851cm-1、1601cm-1、1028cm-1、907cm-1的吸收峰对仪器的读数进行样正,在200~400cm-1区间允许相差±4cm-1,在4000~2000cm-1区间允许相差±8cm-1。上述光谱中,仪器要求在3110~2850cm-1范围内能清晰分辨出7个峰,从1583cm-1最高点至1590cm-1最低点的波谷浓度不小于12%T,从2851cm-1最高点至2870cm-1最低的波谷尝试不小于18%T。

6.把准备好的样品置于样品池中,再放于仪器的样品架上。

7.按下仪器的启动开关,仪器即自动从4000cm-1进行扫描,直到200cm-1自动停止。

8.撕下图纸,取出样品,关闭仪器电源及总电源开关。

9.取下记录笔,放于笔架上,用硬纸板将红外线入口关好。

10.用细绸布将仪器擦拭干净,放置于燥硅胶,盖好防尘罩。

(十四)荧光分光光度计的使用

对仪器进行灵敏校正、波长校正、激发光谱和荧光光谱校正后,按各药品项下规定,配制对照和供试品溶液。道德按仪器说明书要求的方式,选定激发光波长和发身光波长,并在测定前,用一定浓度的对照液校正仪器的灵敏度,然后在相同条件下,读取对照溶液及其试剂空白与被试品及其试剂空白的读数即得所测值。

(十五)PC-3B型药物溶出度仪的使用

1.水箱补水水达到水平线即可。接通电源,预置温度键,按下转轴电机开关。

2.转篮法除另有规定外,量取经脱气处理的溶剂900ml,注入每个操作容器内,加热使溶剂温度保持在37±0.5℃,调整转速使其稳定。取供试品6片(个)分别投入6个转篮内,将转篮降入容器中,立即开始记时。除另有规定外,至45分钟时,在转篮上端液面中间离烧杯壁10mm的取样点吸取溶液适量,立即经0.8μm滤膜滤过,自取样至滤过应在30秒中内完成。取滤液,照该药品项下测定,算出每片(个)试品的溶出量。

3.浆法除另有规定外,量取经脱气处理的900ml,注入每个操作器内,加温使保持在37±0.5℃,调整转速使其稳定。取供试品6片(个),分别投入6个操作容器内,立即开始计时。除另有规定外,至45分钟时,在浆液上端液面中间离杯壁10mm的取样点收取适量溶液立即经0.8μm滤膜滤过,自取样至滤过应在30秒内完成,取滤液该药品项下规定的方法测定算出每片(个)试品的溶出量。

4.结果判断转篮法和浆法结果判断原则相同。6片(个)中每片(个)的溶出量,按标本含量计算,均应不低于规定限度(Q)。1~2片(个)低于规定限度,但不低于为标示含量70%。如6片(个)中仅有1~2片(个)低于规定限度,但不低于Q~10%,且其平均溶出量不低于规定限度,仍可判断为符合规定。若6片(个)低于Q~10%,应另取6片(个)复试。初、复试的12片(个)中仅有1~2片(个)低于Q~16%,且平均溶出量不低于规定限度,亦可羊为符合规定。每个转篮中供试品的取用量如为2片(个)以上,算出每片(个)的溶出量,均不低于规定限度(Q),则不再复试。

5.累积溶出量的测定除另有规定外,量取经脱气处理的溶剂900ml,注入每个溶出杯,加温溶剂使保持在37±0.5℃,调整所需转速,使其稳定。精密称量的供试品6片立即计时,按预先设计的时间间隔准确取样,操作同转篮法。每取一次样品液后立即沿杯壁加入相同体积并经预热到37℃的溶剂。取出的样品液按法测定浓度,计算溶出量和进行数据处理。

6.其他每次测定开始,均应盖上溶出杯盖。测定结束依次关掉转轴电机、控温键、电源开关,去掉溶出杯盖,把转轴提升至最高位置,翻起机关箱。清洗溶出杯。结果较长时间不用,应将转轴取下,擦干后放务件箱内,并放掉水浴箱中的水。

(十六)TDx快速血药浓度检测仪应用

(1)开机前,打开左侧盖,接缓冲液管,同时检查缓冲液量是否充足。注意注射器内不可有气泡,用蒸馏水清洗探头后,用吸水纸轻轻将其粘干。

(2)启动开关ON(在TDx机左后位置),开机。

(3)电脑操作视屏显示DATE,按月、日、年顺序输入时间,如时间序数为个位数,则在其前面加“0”。按下“STORE”键,视屏显示“TIME”键。

(4)TDx机预热5分钟(倒数计),注意显示屏出现“REAKY”。

2.药物浓度检测操作程序

(1)样品准备:抽取病人血液1~2ml,静置使其自然沉淀,用吸管吸取50l的血清加入样品杯,注意检查血样品有无气泡。

(2)准备药盒:由冰箱(2~8℃)内取出检测的药品试剂盒(注意核对),水平轻轻来回摇动试剂盒,以避免药物沉淀致吸取药物浓度不均。打开3个瓶盖与药品一致不可乱盖,然后将试剂盒放入TDx机试剂盒槽内。

(3)准备转盘:用标有数字之样品转盘,按检测样品数由转盘1~20顺序加入等量的玻璃比色管和塑料样品杯。加样操作同样品准备。然后锁上转盘,手持转盘中央之轴顺时针方向转动,听到“咯嗒”一声,将转盘放入TDx机中。

(4)盖上机门,视屏显示“READY”后,方可进行以下操作。

(5)进行检测,按下“RUN”,之后一切由仪器自动操作。注意此期间内绝不可打开机门,不能按键。荧屏显示“DONE-REMOVERPAK”,取出试剂盒。同时伴有“…”声,即检测全部完成。打开机盖,取出试剂盒,盖好盖,位置不能弄错,然后盖上机盖,将试剂盖放入冰箱(2~8℃)保存,以备后用。

(6)分析结果,清洗探头。

(7)写出报告在操作过程中听到“…”声响时,应立即查看荧光屏上指令,及时发现问题并予处理。若无问题则是全部检测结束,应取走药盒,撕下打印报告。

(8)重读资料按“SYSTEM4.IRUN”,把结果打一遍,按“SYSTEM4.2RUN“把结果显示一遍。

(9)标准曲线、质控及光路检测、温度检测、吸量检测等均按有关程序操作。

(1)按“PRIME”键多次。

(2)将探针拉到中间位,用蒸馏水洗探针头,然后用清洁软纸吸干净。

(3)若停机数天后才启动TDx机,需要打开TDx机左侧机盖,取出连接缓冲瓶的塑料管,然后接蒸馏水瓶。再按“PRIME”多次,清洗注射器。

(4)将TDx开关按到“OFF”,开启机门,查看TDx机内有无试剂污染,若有可用清水棉球擦之。

(十七)气相色谱仪使用

1.固定相气液气谱法的固定相就是已涂渍固体液的担体。常用于血药浓度测定的固定液有SE-30、OV-1、OV-17及PEG-20M以上,适用于分离甾体、生物碱及绝大多数药物。OV-17等为中等极性物,最高使用温度为350℃,对有极性官能团的药物有较大的选择性,PEG-20M是分子量为2万的醇类固定液,极性较强,最高使用温度在250?/FONT>C以下,适于极性较小药物的分离。

用于涂渍因定液的担体是无机硅藻土类担体,有酸洗和碱洗耳恭听两种,其表面已纯化,适用于气液色谱法。

固定液的涂渍方法,以使用OV-17为例说明,称取占担体为3%的OV-17,溶于乙醚或氯仿中。将称好的担体一次加入,迅速搅匀,并不时搅拌,放于通风处,待溶剂完全挥发后放在烘箱中加热老化以物底除去残余液体及挥发性杂质,并促使固定液牢固均匀地分布在担体表面及毛细孔洞中。

层析柱在填装前,先将不锈钢用5%NaOH、水、乙醇、乙醚依次洗涤,最后用水冲洗至中性,烘干。如选用的是螺旋形柱,则用抽气法将涂好的担体装入。如先用U形柱,则边装边敲击,将装好的柱联入仪器中,用较低的载气流速,在略高于实验使用温度但低于固定液的最高使用温度条件下,处理几小时至十几小时直至基线走直为止。

2.流动相流动相(常称载气),有氮、氢、氦、氩等气体,由高压瓶供气。载气中的氧、烃类及水分等杂质必须除尽或只允许一定的限量。载气流量变化应小于1%。

3.进样与检测经过前处理的试样,取1~10μl注入仪器的进样品,速度要快,否则影响柱效;每次注样必须准确一致,保证出峰的重现性。之后,由载气将组分带到检测器。检测器能将组分的浓度或质量转变为容量测量的电信号,以峰的形式记录或显示。气相色谱法的灵敏与否,关键在于检测器。适用于血药浓度测定的检测器有以下几种:①氢火焰发离子化检测器(FID),对有机物质的检测限为50mg。②电子捕获检测器(ECD),对负电性有机物的检测限pg级。③氮检测器(N-FID),对含氮有机物的检测限为ng级。④质谱检测器(NSD)常和气相色谱仪联用。若将特征碎片重复扫描几百次,获得由强度及扫描时间组成的色谱质谱峰,检测限在ng-pg级。

(十八)高效液相色谱仪的使用

1.色谱柱它包括空柱和填料。空柱是内壁抛光的不锈钢管,内径为4~5mm,长100~250mm。按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净,用匀浆法填充固定相。将此柱装入仪器的管路中,用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液,用正己烷(含0.05%甲醇)或甲醇:水(83:17)为流动相测定柱效及分离度塔板数在2~3万/ml以上及分离度在1.5以上者,柱效好。为防止柱污染,常用1个50mm长,4~5mm内径,装有硅胶(40-50mm)或立柱相同填料的保护柱(预柱)接在主柱之前,以延长色谱柱的寿命。反相键合相柱用毕。必须用水充分流经,以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚,再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。

2.流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中,经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱,最后自检测器流出或收集或作废液回收。用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法(isocratic dlution),即自洗脱开始到结束,溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法(gradicnt clution),即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加。须按一定程序不断改变流动相的浓度配比,从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离,而整个色谱过程缩短。必须注意,梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。

3.检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收,荧光发射和电化学三种。紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物,大多数药物分子对紫外光有吸收,故能较普遍采用,检测限有0.1μg左右。紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器,既能使流动相停流作组分的定性定量检测,又能提高测定灵敏度,重现性较好。荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用。80年代应用激光替代氙灯光源,光强度增加了3~4倍,对某些药物的检测限可达pg级。电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池。常用于检测酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物。流出组分进入2μl的薄层电解池,在一暄电压下电解产生电流,放大后检测,检测限pg级。

4.数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统,除记录谱外,还能自动记录峰的保留时间,能自动积分求算峰面积,并能按照预定的程序作有关计算,报告分析结果。

四、仪器设备的保养与维修

仪器设备在使用过程中,由于仪器本身(如寿命、易损件)或人为(如违反电压、温度、湿度)等因素,常会发生故障或损坏而被停止使用,必须及时进行维修。仪器设备在使用过程中,由于物体的运动,必然全产生技术情况的不断变化,因此要经常做好仪器设备的保养与维修,以改善其技术状况。

(一)仪器设备的保养与维修管理

1.日常保养一般实行三级保养制:

(1)日常保养(或称例行保养)由仪器保养人负责。它的内容是:表面清洁、紧固易松动的螺丝和零件,检查运转是否正常,零部件是否完整。日常保养的项目和部位较少且大多数在仪器设备的外部。

(2)一级保养:由仪器保养人按计划进行。主要是内部清洁,检查有无异常情况(如声音、湿度、批示灯等)局部检查和调整。

(3)二级保养:是一种预防性的修理,由仪器保养人会同修理人员共同进行,检查仪器设备的主要部分或主要部件,调整精度,必要时更换易损部件。

2.仪器设备检查是对仪器设备运行情况、工作精度或磨损程度进行检查校验,针对发现问题,提出改进维护措施,有目的地做好修理前的各项准备,以提高修理质量,缩短维修时间。一般与二极保养结合进行。从检验性能来区分,可有两种性质的检查:一是功能检查;二是精度检查。功能检查测定仪器设备的各项功能是否符合仪器说明书技术文件要求。精度检查指测定设备的精度,特别是计量仪器,如天平、分光光度计等,还需定时由国家计量部位来检查、鉴定。平时的定期检查还应特别强调设备的安全检查,包括仪器本身的安全性、用电安全和周围环境的安全。

3.仪器设备的修理主要由维修人员负责。修整可分为:

(1)小修理:工作量最少的局部修理。在设备所在地点更换或修复少量零件或调整设备的结构,以保证设备能使用到下一次修理。

(2)中修理:需更换与修复设备的主要零件或为数较多的其他损坏部件或校正仪器以恢复其精度,达到设备规定的技术参数。

(3)大修理:是工作量了大的一种修理,有时需将设备全部解体,更换或修复全部损坏的零件,恢复设备原有的精度、性能和效率。

4.仪器维修登记制度仪器设备在保养维护和修理后必须登记,包括:保存文字记录,记载修理日期,使用人主诉仪器故障现象,修理人所见的故障现象,故障原因,排除方法,零件或电路改变情况,修复后的检验情况(如不能修,说明原因和建议),由修理人和保养人签字,用以保存完整的设备技术档案,便于修理人员了解仪器设备的历史,也可作为对使用人、保养人和维修人的工作考核依据。

5.设备维修的主要技术指标

设备保养与维修管理的主要技术指标以设备完好率表示:即完好和基本完好设备占总设备件数的百分率。一般仪器设备技术状况分为四个等级:

(1)设备完好:性能良好,盍使用正常,零部件齐全,无明显磨损、变形和腐蚀,仪表批示系统正常。

(2)设备基本完好;主要性能保持良好、运转基本正常,不经常出现故障,主要零部件齐全,虽有一定磨损、腐蚀、但不影响使用,仪表批示系统基本正常。

(3)设备情况不良:主要性能不良,常出现故障,主要零部件受损,使用受到影响,仪表指示系统有一定程度的失调,停机修理或待修,上述情况出现其一者。

(4)报废或待废:己丧失主要性能,不能正常运转使用或受到严重影响,经常出现较大故障,主要零件不全,要有专人负责保管,务必经常保持完整清洁。

(二)常用药学设备的保养与维修

(1)天平与砝码要有专责保管,务必经常保持完整清洁。

(2)天平应放在干燥、无日光直身与不易受热、受冷的地方,室内应无有害气体或水蒸汽。天平台必须平坦、牢稳、坚固。

(3)天平内应放置干燥剂如硅胶等,并需定时更换以保证天平内空气干燥。

(4)天平在放妥后不应经常搬致力,必须搬动时,需将天平盘及横梁零件先行卸下。

(5)天平各部件要定期检查,保持清洁,各零部件若有灰尘,应用细软毛刷轻轻扫指,注意铁使螺丝转动或损害刀刃。

(6)如发现天平失灵、损坏或有可疑时,应即停止使用,不得任意拆弄零件或装配零件。

(7)凡自干燥器内取出称样,要称量前必须仔细检查空中底部是否沾有污物。如沾有,应清除后方可进行称量。

(8)天平使用期间,应按规定由国家法定计量单位定期鉴定,并持有合格证书。

(9)天平砝码应保持清洁,勿沾有棉毛纤维、灰尘及化学药品。天平光幕表面及镀铝的反光镜不准用布擦拭,以免磨损光洁度,必要时可用软毛刷轻指。

(10)使用砝码应用专用镊子夹取。

(11)砝码在使用一定时期后,要用擦镜纸轻轻揩拭,严禁任意拆卸、刮削或用去污粉擦洗。揩拭后需经校准方可再用。

2.WXG自动批示校准旋光计的保养

(1)旋光计必须放置暗室内内或专用木盒内,存放的房间必须注意防潮,防腐蚀性气体,更不可放置于高温炉旁。

(2)使用仪器时,应保持有足够的电压。仪器所标注电压一般为220V,加实测时电压不符合此标准,应通过调压变压器将电压调至220V。否则,电压低会使仪器灵敏度降低;电压高会使小数盘摆动不定。

(3)测定管、光学下班片和橡胶圈,每次洗涤后,不可置烘箱中干燥,以免变形及橡皮圈发粘。

(4)测定管盛放有机溶剂后,必须立即洗净,以免橡胶圈受损发粘。

(5)测定管两端的光学圆玻璃片,使用时需特别小心,避免磕碰,并只能用擦镜纸揩拭,以防磨损。

(6)被测样品超过测量范围时仪器可在±45°C处自动停车。此时应取出测量管,按一下样品室前右上角的按钮,仪器即可自动回零位。

(7)如旋光计上的淘汰系钠光灯,使用时间一般勿超过2小时,并不宜经常开关,开启后禁止震动。

(8)每次使用后仪器各部位均应仔细检查,保持干净,然后放置原处。

(9)本仪器久用后,其机械部分磨擦阻力增大,可打开后门板,在伞形齿轮及涡轮涡杆处加少许润滑油以减少摩擦力。

(10)如无钠光灯或滤光片,可将光线通过硫酸铜或铬酸钾的混合液(CuSO45HO28.1g和K2Cr2O79.4g溶于300ml蒸馏水中),液层厚度为3cm。

3.雷磁25型酸度计的保养与维护

(1)应置于平稳的台上,室内应干燥,避免震动,并防止灰尘与腐蚀气体侵入。

(2)玻璃电极球部系用极薄的特种玻璃制成,极易碰破,使用时需特别小心,安装电极时,应使甘汞电极下端较玻璃电极球部稍低约2mm,以免试杯底碰破其球部。

(3)玻璃电极初次使用,应将电极球部先在蒸馏水内浸泡数小时,最好浸泡一昼夜。用后也应把球部浸泡在蒸馏水中,电极插头上的有机玻璃管有优良的绝缘性能,切忌与化学药品或油污接触。

(4)下班电极如沾附污秽不易洗去可先后用乙醇、乙醚、蒸馏水等浸泡洗涤。

(5)221型玻璃电极的线性范围为0~9.5,测定pH9.6以上溶液时应校正钠离效益引起的误差。一般不应测强碱性溶液(pH11以上)。如必须测定应尽量快速测,使用后,球部应以1mol/L盐酸液浸泡片刻,再用蒸馏水洗净。

(6)甘汞电极在使用时应注意氯化钾是否充足,必须能够浸没内部的小玻璃管下口,且在弯管内不准有气泡将溶液隔断。溶液不足时应加入纯饱和氯化钾溶液。

(7)甘汞电极的下端为一塞有石棉丝的毛细孔,在测量时允许有少量氯化钾溶液流出,但决不允许有被测溶液流入。如有其他溶液流入甘汞电极内,将导致测量结果不准确,故在使用时最好把甘汞电极侧面的小橡皮塞拔去以保证有足够的液位差,断绝被测溶液流入的可能性。

(8)甘汞电极不用昌,可用橡皮套将下端毛细也套住切勿与玻璃电极一起浸泡于蒸馏水中。

(9)每次测定前,电极及试杯均应充分洗净(最好用被测溶液冲洗耳恭听一次)。如测定弱缓冲作用的溶液,应注意玻璃电极表面不易平衡,电极在测定前虽经充分冲洗,但仍有读数不胜数逐渐改变的现象,此时宜重换一份被测液再测,直到读数在一分钟内改变不超±0.05(pH)为止,取最后一份读数为溶液的pH值,有时需换测三至五份。在测定极稀溶液或蒸馏水时,其读数会随校正仪器所用缓冲液的pH值而异用酸性缓冲液校正后测定值偏酸,而用碱性缓冲液校正后测定值偏碱,因此在测定极稀溶液或蒸馏水时,应用邻苯二钾酸氢钾标准缓冲液(在25°C时pH=4)校正仪器,按上述法测被测液,再用硼砂标准缓冲液(在25°C时pH=9.18)校正仪器测定疲测液,有时被测液需换五至六份,两次校正的最后两份的pH值差应不大于0.1,取其平均值为溶液的pH值。

(10)校正仪器用的标准缓冲液,应选择与被测溶液相接近者,以减小误差。

(11)校正仪器用的标准缓冲液与测定的准确度有直接关系,最好用单一种酸性或碱性盐来配制,如用两种盐类混合配制则误差较大。使用的试剂要在2级以上。硼砂易风化吸收二氧化而,遇此情况应重结晶后方可使用。配制溶液应用新煮沸放冷的蒸馏水,缓冲液在使用过程中应尽量避免接触空气,以免吸收二氧化碳使其pH值改变。一般使用期限勿过长,如发现霉菌,则应弃去重新配制。

(12)搬动仪器应将量程选择开关置于“0位”,此时已将电表断路,以保证移动时电表的安全。

(13)酸度计及所附电极组应每年检验一次,以保证准确无误。

4.折光计的维护和保养

(1)每次使用完均需整洁一次,然后装入专用的木盒中,盒中放置硅胶干燥剂,以免受潮。

(2)滴加样品所用玻棒吸管,在滴加栓品时不可碰击棱镜面需用擦镜纸或脱脂棉轻轻揩拭。

(3)测定完毕,棱镜面应按使用方法(7)进行清洗,使用恒温器,必须倒尽金属器内的积水。

(4)测定油脂类栓品后,必须用丙酮或乙醚拭净沾有检品的一切零件。

(5)折光计不可用来测定强酸、碱或有腐蚀性的物质。

(6)校正用玻块,应保持完整,绝不可碰遗失以免损伤。

(7)折光计需用放置于干燥无尘室内,不可在有酸碱性气体或潮湿的试验室中使用,更不可放于高温炉或水槽旁。

5.72型光电分光光度计的维护保养

(1)供给仪器的电源电压变化范围不应超过190~230V。供电电源插座上须装有地线。

(2)仪器应安装在不易振动的台上,以免影响微电计指示光点的稳定。应保持周围环境清洁、干燥、无腐蚀性气体存在,并避免阳光直射。

(3)使用时,应经常开闭光路闸门,以核对微电计的“0”点位置是否有改变。

(4)应注意吸收池在其架内的位置,应尽量使其保持前后一致,否则易造成分析误差的准确度。

(5)测定尽量在吸收度值为0.3~0.7的范围内进行,这样可得到较高的准确度。

(6)单色光器电源电压,在被测液色度不太强的情况下,应采用较低电压的电源(5.5V)。这样不但可以降低单色光器部分的温度,且可以延长光源灯泡的寿命。

(7)仪器的连续使用时间不应超过2小时,可间歇30分钟后再继续使用。

(8)吸收池每次使用完,均应用蒸馏水洗净揩开,放在吸收池盒内。

(9)搬动时须小心轻放。

6.751型分光光度计的保养与维修

(1)为确保仪器工作稳定,在电源电压波动较大的地方,应采用稳压措施,最好另务一台稳压器。

(2)仪器接地要好,一切裸露零件的对地电位不得超过24V。当仪器工作不正常,哪无输出、批示灯不亮或电表指针不动时,要先检查保险是否融断,后检查线路。

(3)新仪器使用前及修理后再使用,均应对仪器性能进行综合检定。波长精度还应定期校正。对在紫外区波长精度要求高的分析,应于每次分析前进行波长检查(一般可用氢灯的486.1nm和655.3nm两条谱线进行核对,可不必全面进行校正。)

(4)要经常更换仪器中装的干燥剂,如发现变色即应取出烘干再用。要严防潮气侵入。光学部分受潮后则会发生浑光甚至发霉,从而影响单色光的纯度;若放大部分受潮,则使仪器不稳定。

(5)测定前,先将仪器各暴露部分如灯室反射击镜等上的灰尘用干燥空气吹除,切勿擦拭。如有油污或灰尘太多吹除不尽,则可拆卸后然后再用清洁蒸馏水冲冼,干燥后装还原位。

(6)光源如氢灯或钨灯泡可用乙醇擦拭干净后使用。换灯光或调节灯位置时,不可直接去拿灯泡因手汗中含有氨基酸或其他污物,灯泡通电受热后可留下指纹或其它污迹而影响光的强度。

(7)注意保护吸收池的光学表面,不可用手擦拭或抚摸,避免手汗或污物的污染。测定手应立即倒出被测溶液并及时清洗干净(一般用配制溶液的溶剂洗涤数次后再用蒸馏水洗净。若太脏,可用新配制的铬溶液短时浸泡洗涤,并以蒸馏水反复冲洗干净)。

(8)仪器停止工作时,必须切断电源。将选择开关置于“关”,狭缝旋转到0.01刻度,波长旋至625nm,透光率旋钮至100%上。为了避免仪器积灰和被污染,仪器不用时要用罩子将整台仪器罩住,并在罩内放数包硅胶防潮。

(9)751型紫外光光度计常见故障、可能原因、检查方法及维修处理见表10-1。

表10-1 国产751型分光光度计常见故障及其维修处理

(1)放大器稳压电源无输出;
(2)20蕊连接线脱焊;
(3)指零电表线圈损坏
用万用电表直流挡,按线路所注接脚,检查稳压电源插座各点电压,若均无电压输出则整个稳压器电源有故障;若仅几组无电压输出,则可能连接线有的脱焊;若用电阻档检查主插座无指针偏转,或用万用电压电阻档直接检查指零电表,指查指零电表,指针仍无反应,则动线圈短路 (2)检修指零电表线圈
电表指针偏右无法暗电流调节器调节至中间位置 用万用电表直流电压档检查放大器插头有无电压输出;如电压正常则为直流放大器发生故障

在评价样品纯度之前,首先需要鉴定待测杂质的类型,如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质,进而确定在特定溶液条件中, 能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化特性 (化学分析或物理特征)。而纯度则是指待测杂质含量低于某个特定水平。需要注意的是,上述说明中并没有要求描述杂质的性质。纯化过程可能已将某一杂质的浓度降低到检测下限以下,但色谱峰中还有残留。毫无疑问,表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。由于大多数分离方法都能够有效地去除非蛋白质类杂质,因此本章节将主要介绍蛋白质样品中蛋白质类杂质的检测方法。有关核酸、脂类、碳水化合物杂质的检测方法在本系列其他卷中有所介绍。

随着蛋白质类生物制品的流行, 蛋白质纯度已经成为药品管理的重大问题。人用药品注册技术要求国际协调会 (TheInternationalConferenceonHarmonisation,ICH) 关于生物制品的质量指导原则(ICHQ6B,1998) 中考虑到了原料药(基体材料,bulksubstance) 和药物产品 (药物剂型或成品)中的杂质成分, 并认可了生物分子(如蛋白质)的固有异质性 (inherentheterogeneity)。指导原则中阐明:「除了评价原料药和药物产品的纯度可能由预期产品和多种产品相关物质组成——之外,制造商还应评价可能出现的杂质成分。这些杂质可能是过程相关或者产品相关, 它们可能是结构已知的、部分定性的,抑或是未经鉴定的。」该指导原则进一步区分了过程相关的杂质(由生产过程产生,包括宿主细胞蛋白质、宿主细胞 DNA、细胞培养诱导物、抗生素以及其他下游生产过程产生的杂质) 和产品相关杂质,包括生产或储存过程产生的分子变异体(molecularvariant), 这些分子变异体在活性、有效性和安全性等特性上都无法达到预期产品的效果。」该指导原则认可了上述的分析能力。例如,有关原料药指导原则中提到「生物工程制品和生物制品的绝对纯度很难测定,结果往往依赖于所选择的测量方法……因此,通常将多种方法结合来评价原料药的纯度。选择和优化分析过程,应该着重考虑目的产品与产品相关物质以及与杂质的分离。」有关药物产品的讨论类似于原料药,但是还介绍了产品降解以及由于辅料 (excipient) 干扰而造成的产品相关杂质的测定方法。

目前有一些高灵敏度的方法可用于检测样品中的杂质 (表 38.1)。其中每种方法测定分子的一种特定物理特性。方法的选择依赖于以下标准:①可用于检测的蛋白质的量;②待测杂质的性质;③所需的检测精度;④所需的检测灵敏度;⑤可能干扰到该方法的蛋白质及其溶剂特性。最为简单和常用的方法是,经一次或多次分离后证实只有一种组分可被检测到。若纯度标准为只可以存在一种可检测物质,则需用多种分离手段检测杂质。

当所选择的某种检测方法无法从主要分析物中分辨出一种未知杂质时,推荐使用正交的方法 (orthogonal)。最后,谨慎处理样品非常重要,这样可以防止在制备分析所用的样品过程中改变其杂质谱。并且,洁净的环境、适宜的温度及适当材质的容器都会为分析提供帮助。

很多合适的方法已经在本卷中的其他地方详细介绍,这里不再赘述。有一些分子质量或分子大小的检测方法在本卷其他章节也有概述,因此在本章的讨论中,有时会引用/参考相关章节的细节 (Rhodesetal.,2009)。本章的重点将放在介绍更适用于检测杂质而不是定量测定大小、质量等其他分子参数的方法上。此外,本章还概述了方法选择的原则, 一些方法的局限和优势, 并描述了一些不涉及分离的纯度测定方法。

一、蛋白质的组成和活性分析

一些方法能够量化氨基酸、特定辅基团或活性位点的摩尔数,可以用来评价蛋白质样品的纯度。如果已知纯蛋白质的活性,那么单位活性测量可以用来检测相对纯度。这些方法是间接的,因为总要将分析物假设为不含杂质的纯品,并将该假设纯品的量作为参照。这些方法主要适用于纯化过程早期的多相系统,或适用于需要特殊环境来保持活性的分子 (如膜蛋白)。一般需要检测两项: 第一项是分析所用样品中蛋白质 (或原料)的总量; 第二项是定量已知的活性对象或其他特殊的分析对象。然后根据蛋白质的总量,计算出相应的预期分析对象的量。纯度则以分析对象的测定量和预期量的比值表示。使用末端基团分析法(Chang,1983)、特殊辅助基团定量分析法和酶活定量分析法(Biggs,1976) 等都可以非常好的量化纯度。本方法的详细信息 Rhodes 等(2009) 在本书中有介绍。

蛋白质的组成和活性分析仅能说明是否有杂质存在,通常很少能提供有关杂质的性质信息 (如大小和电荷)。除非杂质干扰到测定过程或蛋白质活性,活性检测可能无法提供有关杂质的任何信息。因此,实验者无法得到足够线索以去除杂质。

电泳法提供了最简单、成本最低,并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高的手段,因此最为常用。由于成本极低且相当简单,这些方法常被用做蛋白质纯度第一步筛选,甚至应用于初期高异质性的样品。本书中其他章节介绍了 SDS 凝胶电泳以及利用电泳测定分子质量和大小的方法 (Rhodesetal.,2009)。这些方法都可以单独测定样品的纯度,方法的选择取决于希望检测待测蛋白质的何种性质 (表 38.1)。如果预期杂质与目标蛋白质分子质量有差距,SDS 凝胶电泳可以分辨出杂质。对于分子质量相近但氨基酸组成不同的分子,SDS 凝胶电泳一般不能区分,但是在非变性凝胶电泳中它们有不同的电泳迁移率。另外,几乎任何大小的蛋白质都可以通过等电聚焦法分离。有关等电聚焦法在本书的其他章节中有所介绍 (Friedman,2009), 这里不做详述。

根据采用的电泳检测方法的类型, 所需样品量从纳克级到微克级。由于每种杂质在特定样品中占据固定的质量分数 (weightfraction),而杂质的检测依赖于其总量,因此上样量过载的胶也许能够更有机会检测到某种杂质。然而,样品上样量的上限取决于样品溶解度,并且需要基于分辨率的考虑 (Lunneyetal.,1971)。一般后者的限制性更强,因为样品浓度较高或者大体积样品量会导致谱带扩张和变形。由于过载造成的谱带扩张将难以分辨具有相似电泳迁移率的杂质。然而,电泳这种最灵敏的谱带检测方法 (需要的样品量最小) 不适于回收样品。如果蛋白质样品已变性或者已在极端条件下溶解,一般很难再回收活性蛋白质。如果使用的是非变性电泳,则可通过电泳提取(electirophoreticextraction) 从凝胶中回收样品(Friedman,2009;Garfin,2009)。但是变性电泳可能无法回收天然蛋白质 [例外请参见 Burgess,(2009)]。复性成功与否很大程度上取决于蛋白质的结构。较大或多亚基的蛋白质恢复天然构象的可能性比小单体蛋白质要小。

制样的方法根据所选用电泳方法的性质而定。读者可参考本卷其他章节中有关非变性凝胶电泳和等电聚焦电泳的讨论。最常用的 SDS 凝胶电泳是蛋白质纯度检测的「第一线」(front-line) 方法。由于通常纯度评价是非定量的,因此不需要关心诸如极端大小分子的非线性迁移、蛋白质修饰造成的迁移异常以及 SDS 结合不均勻等 Rhodes 等 (2009) 讨论过的问题。另外,需要考虑样品处理和制备过程中的一致性和均一性,以及分离过程中样品所处的环境。例如,制备均一的蛋白质样品时,未彻底还原二硫键将会使结果表现出异质性。同样,凝胶交联不均一导致的胶内迁移率差异,也会造成对结果的错误判断,但是适当的重复和对照会使这种可能性降到最低。

通常,实验者并不知道一个样品中所有蛋白质组分的大小,因此很难预测胶的浓度,从而以最佳效果分离一组蛋白质组分。梯度胶 (gradientgel), 也称为分级孔隙胶 (gelsofgradedporosity), 能够覆盖非常宽的分子质大小范围。尽管梯度胶不可能产生最好的特定分离效果,但是它可以覆盖最宽分子质量范围,从而最大可能的鉴定某种杂质。分辨杂质的能力主要取决于所选择的胶浓度梯度范围。梯度的设计应该使目标蛋白质条带处于中间的胶浓度。胶顶端丙烯酰胺的浓度 (低浓度) 应该足够低,从而使大分子质量的杂质能够进入到凝胶基质中。胶底部 (高浓度) 浓度应该足够高,使小分子蛋白质能够保持在凝胶基质中。通常预制梯度胶的最低浓度是 4% 丙烯酰胺,高浓度极限标准为 20%。如果这个范围不合适, 可以制备低至 2%、高至 40% 浓度范围的胶。分子质量大约 IMDa 的蛋白质应该能够穿过 2% 的凝胶基质。通常大多数梯度胶的丙烯酰胺高浓度不超过 30%。即使在长时间电泳中也仅有非常少数的多肽能够穿透 30% 凝胶。梯度胶的浓度范围决定着胶的分辨率。因此,虽然 2%~30% 的梯度胶能够检测最宽范围的分子大小,但是在分离分子质量几乎相同的两种蛋白质时,分辨效果却不如 8%~16% 的梯度胶。

梯度的选择很大程度上取决于研究者对整个待测系统的了解。例如,如果不存在特别小和特别大的分子,则最好选择窄的浓度梯度范围的胶或浓度恒定的胶。

如果需要特殊的梯度,制作梯度胶的过程与制作常规聚丙烯酰胺凝胶的过程差距甚微,与用于沉降的蔗糖梯度制作过程也很类似。与常规聚丙烯酰胺凝胶制备过程相比,梯度胶制备难点在于两块不同丙烯酰胺浓度的胶必须平行制作。而比蔗糖梯度制作麻烦是因为梯度胶有丙烯酰胺聚合的时间限制。目前已有一些商业化梯度形成仪,而具体技术方法上的不同可以通过査找相关文献来了解。

梯度胶的电泳过程类似于常规电泳法 [Rhodes 等 (2009) 及本书中其他部分介绍]。

胶分析所用的染色手段由预期污染物决定。可以通过将其他方法与电泳法结合来完成二维凝胶电泳分析,由此增强电泳方法的潜在灵敏度及其获得的信息。一般第二维是梯度 SDS~PAGE, 而第一维可能是非变性凝胶电泳、等电聚焦 (isoelectricfocusinggel) 或者不同条件下的变性电泳 (如没有二硫键还原)。

等电聚焦也能检测宽泛范围的污染物,而且可以与电泳方法联用。商业化预制凝胶在同一块胶上的等电点覆盖范围可达 3~10。等电聚焦步骤见本书其他章节,这里不复述。等电点覆盖范围广是一个相当大的优势,而对于等电点相差细微的蛋白质, 可以通过减小等电点范围 (如 4~5、5~8) 来提高区分的灵敏度。除了能够分离等电点不同的分子,等电聚焦法还可通过其他性质来分辨污染物。

鉴于凝胶电泳法的简单和低成本,通常将其作为纯度评价的首选方法。然而,在采用该方法时也需要谨记一些潜在的问题。对于变性凝胶, 可能出现假阴性和假阳性现象。

如果发生杂质共迁移 (comigrating) 或者杂质无法进入凝胶的情况,则会出现假阴性。因此应该将整块胶,包括浓缩胶和分离胶都染色,并且需要检验蛋白质染料是否合适。例如,样品条带若残留于上样孔或处于浓缩胶和分离胶之间,表明存在高分子质量的杂质,或者杂质溶解度有限。同时,常用的蛋白质染色剂(proteinstain), 如考马斯亮蓝与纤维状蛋白质及糖蛋白的结合力较弱,如此将低估此类杂质的含量。而假阳性的产生, 可能是由于样品制备时发生共价修饰,或者胶不均一和氧化剂残留。非变性凝胶中也会出现类似问题,此外目标蛋白质或杂质净电荷的不确定性也会导致意外发生(Rhodesetal.,2009)。如果杂质的静电荷为零或者与目标蛋白质相反,杂质将不会出现在胶上, 除非使用中心上样水平凝胶

等电聚焦相关伪迹 (artifact) 的产生主要是由于用来生成 PH 梯度的多聚两性电解质颗粒与蛋白质相互干扰,造成条带 (一般是弥散的) 在胶上的结果与目标蛋白质的等电点无关。检测这种可能性的一种方法是从中选择一条条带分离出蛋白质,并且用相同的等电聚焦过程分析分离出的蛋白质。如果原结果分布反映了样品中的实际异质性,则分离出的蛋白质只能形成与原始同样的点。然而,如果原始条带是假象,那么分离出的蛋白质将重现原来的分布模式,包括虚假条带。

凝胶过滤色谱法是检测与目的分子大小不同的杂质的最简单方法之一。这一方法无破坏性并且非常快速。因为这是一种「区带方法」(zonalmethod), 样品通过凝胶柱时会被稀释, 因此需设置恰好高于最小检测限度的起始浓度。而确切使用量则取决于用本方法检测杂质时的灵敏度。

本卷介绍的测定蛋白质大小的样品和凝胶柱制备的方法, 在本章中将用来评价杂质 (Rhodesetal.,2009)。两种应用唯一的区别在于,后者所用检测方法不仅需要对目标蛋白质的灵敏度高,对杂质同样要求高灵敏度。尽管评价样品纯度时并不需要校准凝胶柱,但这样做有两个好处。首先,实验者使用校准凝胶柱可以获得有关杂质大小的信息;其次,使用校准凝胶柱可以在检测杂质存在的同时测定分子质量。为此, 通常需要进行两个测定: 第一个是蛋白质的非特异测定 (如测 280nm、220mn 吸光度);第二个是特异检测 (酶活检测、免疫学检测、质谱、多角度光散射检测等),用来确认所分析蛋白质的身份。

杂质在色谱图中可能表现为独立的峰,也可能使洗脱谱变宽 [如肩台(shoulder)]。原则上,洗脱谱应该接近高斯分布 (边缘有微小的偏移,见问题和局限)。如果分析蛋白质峰有强烈偏移、峰有肩台,或者特异和非特异测定结果不相符,说明样品中存在杂质。

凝胶过滤色谱法检测分子大小的灵敏度低于电泳法。一般来说, 凝胶过滤实验需要的材料量大于电泳法所需。由于凝胶过滤色谱通常在天然状态下进行,因此结果可以反映样品异质性。如果蛋白质以一系列稳定的寡聚物形式存在 (如脂肪酸合酶),在凝胶过滤色谱将表现出异质性。同样,发生快速、可逆的自联作用的蛋白质会表现出异常的浓度依赖性洗脱谱。这些情况下,可通过进一步测定来区分异质性和分子偶联。例如,从不对称峰和加宽峰中选取不同部分来重复胶过滤色谱法,或采用本章和本卷介绍的其他方法测定选取的部分。这些方法都可以提供目的分子的有用信息。

2.反相高效液相色谱法

另一个应用广泛的色谱分离方法就是反相高效液相色谱法 (reversedphaseHPLQ。

这种方法用诸如改性硅介质等非极性基质作为固定相,进行极性递减的梯度洗脱。例如,在含 0.05% 三氟乙酸 (TFA) 的缓冲液中,蛋白质将通过疏水性氨基酸与 C-18 改性硅介质结合,从而结合于固定相,再从 0.05% 三氟乙酸逐渐提高到一定量合适的有机溶剂洗脱蛋白质, 如乙腈、甲醇或乙醇等,通常三氟乙酸含量保持一致。流动相中的有机溶剂减小了蛋白质与固定相的亲和力,从而将蛋白质洗脱下来。与其他梯度洗脱方法一样,缓慢的梯度洗脱可以获得最佳分辨率,但是首次实验时最好先进行快速梯度洗脱,如此可以得到主要分析物的洗脱最适溶剂条件,并可以根据与固定相亲和力不同来筛选可能的杂质。

蛋白质的检测通常是基于 215~220nm 处的紫外线吸光度来检测肽段,而不是采用 280nm 检测的芳香族氨基酸方法。暂且不论准备时间,梯度洗脱可在 Ih 内完成,大部分优化后的洗脱步骤将在 15~20 min 内完成。

由于该方法简单且快速,具备现成的合适设备,能够灵活应用多种不同特性来分离亲和蛋白质,因此已普遍应用于蛋白质样品的纯度筛选检测。如有必要,可采用多种不同的流动相使样品可以在不同梯度和条件下得到分离,来确定主要分析物的纯度。该方法还可以与其他方法联用 [如质谱法 (见下文)] 来确定蛋白质身份并获得可能存在杂质的信息。值得注意的是,由于有机溶剂的存在,洗脱下来的蛋白质可以预见到有一定程度的变性,不一定能够保持天然构象。使用 C-4 或 C-8 固定相能够将变性可能性降低到最小,这是因为它们与蛋白质有较弱的亲和力,较低浓度的有机流动相就可用来洗脱。许多针对特定蛋白质的操作方案已经发表,HPLC 设备制造商也提供了许多产品信息。

沉降速度法 (sedimentationvelocitymethod) 能够简单快速且非破坏性的来评价一个蛋白质的纯度,这种方法对分子质量和分子大小的比值非常灵敏。关于沉降速率测定法在 Rhodes 等 (2009) 的文献中有简要介绍。一般来说,当使用沉降速率测定法来检测蛋白质纯度时,实验者能够找到的沉降组分不止一种。该方法的优点在于测定的材料范围非常广 (尤其是使用折射式光学系统时),但最大的局限在于,它对分子质量相差小的样品的灵敏度不如电泳技术,甚至区带沉降 (bandsedimentation) 也不可避免这种问题。

本卷中 (Rhodesetal.,2009;Coleetal.,2008) 详细介绍了除区带沉降法之外的一些方法, 如样品制备、选择合适的光学系统及实验结果的分析。如何准备离心来实施速率区带沉降实验 (rate-zonalsedimentation) 可参考设备说明书。利用超速分析离心机来实施区带沉降法的细节可以参考 Eason(1984) 或 Ralston(1993) 的文献, 数据的分析类似于凝胶过滤色谱法。

值的峰,或是代表主要分析物的峰加宽。另外,与凝胶过滤层析法相同,尽管蛋白质纯度很髙,自身结合蛋白质的沉降行为表现为峰加宽或多峰,使用平衡超离心或其他方法可以帮助解决这个问题。

由于质谱法可以直接测定一个样品中共价质量的分布,因此这种方法能够非常简便、灵敏地测定杂质。质谱不仅可以检测杂质的存在,还可以描述杂质的质量特征,因此质谱法常被用于鉴定杂质的来源。除了能够直接测定蛋白质分子质量大小,通过串联质谱 (MS,’MS 或 MS2) 等,还可以鉴定共价改性修饰特征和位点。其中,CBD 和 IRMPD 可以测定相当小的蛋白质 (<15kDa),而 ETD 和 ECD 可用于分子质量较大的蛋白质 (约 50kDa)。除此之外,共价修饰键改性及其位点的测定可以用任意一种常用的蛋白质水解法,如胰酶或溴化氰(CNBr)(Link,2009)。在使用飞行时间质谱 (time-of-flightmassanalyzer)

由于杂质可能与主要分析物有相同的质荷比,因此将质谱法与其他分离方法联用可以增加样品纯度测定的准确度。例如, 如果在凝胶排阻层析的洗脱峰中出现不对称峰,质量检测将帮助区分其是由大小不同的杂质所导致,还是由于自身相关的分子所导致。不同于光散射法基于回转半径 rg(theradiusofgyration) 测量而计算质量,质谱法对蛋白质的质量测量更加准确。

如 Rhod=等 (2009) 所述,目前一些仪器能够进行静态或动态光散射来测定单个样品,或者监控高效液相色谱和场级 (FFF) 分离过程。通过对分子大小和表观分子质量的连续测定,增强了鉴定洗脱蛋白质的能力,能够区别待分析物、待分析物多种形式的聚集体或杂质。光散射法非常简单且无破坏性,并且目前的仪器能够提供一个洗脱时间函数的分子质量图。这样,如果一个紫外线检测峰不对称,多角度光散射 结果不如质谱准确,但是所需的设备更便宜且操作简单。

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