单抗制备技术近十年来进展_百度文库
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单抗制备技术近十年来进展
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【交流】目前国内制备鼠单克隆抗体的现状
想了解一下国内目前鼠单抗制备技术的现状，特别是与其它国家比有何长短。鼠单抗制备是一个非常成熟的技术，但也是对经验，技巧和试验条件有一定要求，或者很高要求的技术。交流经验，互相促进是本贴的目的。 本人2000年出国前，曾做过几年的鼠单抗。成功率还可以，但也就限于每次融合能拿到几个到十几个阳性克隆。至于是否配对，有无实用性等，则没有把握。近两年在美国的一个医学院研究实验室也做鼠单抗，没人具体指导，自己根据这里的条件做。也许这里试验室条件好一些，主要也是环境好培养基本无污染；一次性的培养板，吸管和瓶等基本不用操心。血清用HyClone胎牛血清。但不用饲养细胞，改加重组鼠IL-6。无论融合后筛选和后来的克隆和亚克隆细胞都能生长。原因可能是美国实验动物管理严格，如有替代方法尽量不用动物；另可减少污染机会。但我感觉饲养层细胞对帮助克隆建立有帮助，同时将死亡的细胞碎片清除，也对克隆生长有利。在这里，通常一次融合，最后可拿到30-40个克隆（间接ELISA上清1：10稀释，读数在2.0以上）。根据抗原大小，可有5-7组不同决定簇特异性的单抗。并根据需要，针对性地制备构象决定簇特异性或序列决定簇特异性的单抗。但要拿到理想的单抗，好像还是机会主义，只不过几率增大了。了解过其它的实验室，似乎我们的水平不差，或者比较高。希望国内同行或同学介绍一些自己实验室的情况。 提出问题，大家探讨，促进我们的单抗制备技术发展。谢谢。我也做过一段时间的单抗，总体感觉就是做单抗遇到的情况复杂，周期长，对实验者的实践经验要求较高。虽然国内很多实验室都有这项技术，而且有的还比较成熟，但要真正掌握却不是一件容易的事。当时自己的实验室在这方面没有成熟的技术可以借鉴，一切都得靠自己摸，中间也请教过几个很有经验的老师，但是发现这个实验“拿来主义”似乎奏效不大。在细胞株最关键的时候，还是自己积累的主观经验的判断最管用了。举个例子说吧（班门弄斧一下了），所有的实验指导书上都会说“融合培养后10天左右要及时筛选阳性孔”，什么叫及时，我想恐怕只有做过的人才会有体会，早了可能会造成假阴性，晚了细胞可能会死亡。这就靠自己积累的经验和对细胞生长状态的观察来做出综合的判断了。我做的时候刚开始用过国产的杭州四季青的血清，效果不好；后来也用过Hyclone的胎牛血清，结果第二次换液后就全部死亡，也不知道什么原因。再后来就换了GIBCO的胎牛血清，果然效果不同，细胞生长很好，虽然价格上贵了许多，但总算找到了一种让人放心的血清，以至于后来国内有段时间说GIBCO的血清有可能会断货，老板提前买了一批货村存了起来备用！呵呵，扯远了呵~请教ningbo57战友几个问题：1、加饲养细胞，一般认为一是分泌细胞因子，促进融合细胞增殖；二是可以清除细胞死亡的碎片。我在做的过程中，曾经在亚克隆时，没有加饲养细胞，只是加了完全培养基，而且发现只有在高浓度（&15%）的血清含量时，细胞生长增殖不受影响。不知您有这样的经历没有，您怎么看这个问题？2、用您所说的血清用HyClone胎牛血清。但不用饲养细胞，改加重组鼠IL-6，不知道您一般血清和IL－6浓度用多大？最后可以拿到30-40个克隆，而且上清效价1：10稀释后可达到2.0以上，确实是一个非常令人羡慕的数字，不知道您是否与在国内做的时候做过对比，您认为能够获得这样好的结果最重要的因素是不是因为用IL-6代替了饲养细胞，还是别的什么原因？3、30-40个克隆处理起来工作量是非常巨大的，您一般怎么处理，是全部进行克隆还是只是保留几株好的？如果全部克隆有什么好的办法可以借鉴吗？4、针对性地制备构象决定簇特异性或序列决定簇特异性的单抗，不知道您在制备这一类单抗的时候抗原是怎么制备的，又如何筛选呢？问的有点多了哈，不管对不对，就当抛砖引玉了吧，希望同行们多多的顶，像ningbo57 战友这样从事这么久的单抗制备工作的人园子里可不多哦~~晌磺拜：我是2004年_始做慰沟模浆F在有赡炅耍_始由一位做^20年慰沟睦著做，后砭妥约鹤觯浆F在仍然ψ慰购芨信d趣，因殡m然方法一樱恳抗原都是不同的，有cR床患者w化的味道！F有意1.我一直用a的血清，融合效果不e，很至少]有死亡的F象，而且教我的老f他就用四季青的血清，也挺好的，不知是不是近年a血清的|量提高了；2.我F在的仍然是“每次融合能拿到几个到十几个阳性克隆”，（很羡慕您能“拿到30-40个克隆（间接ELISA上清1：10稀释，读数在2.0以上）”）但由于所在公司可以M行ELISA Kit的_l，M行配Φ脑，K且已有胞因子的慰梗慰够慰梗嗫古πЧ诲e，可以和M口的盒子相比，但也有些不行；3.IL-6的}，有一次在s交瘤U大培BrlF，胞是死亡，一旦加入滋B胞，就生L良好，考]是a生了IL-6依赖，但没有最终确定，请问根据您的经验是吗？4.对您所说的“构象决定簇特异性或序列决定簇特异性的单抗”很感兴趣，（我自己只做过磷酸化的单抗）也如“小蚂哥”一样对制备这一类单抗时抗原的制备和抗体的筛选感兴趣；同样的问题多多，希望不吝指教。谢谢版主的讨论。试着回答一些问题。不同之处可能有两点，一是以前在国内我们主要用免疫荧光筛选，处理量受限；二是在国内融和后用24 孔板培养，得到的阳性克隆相对较少。现在实验室用96孔板培养，ELISA筛选，效率高一些。通常一次融和种10块96孔板，培养基用DMEM/F12 含20%FBS ，10 U/ml IL-6, HAT筛选。3-5天后添加一次含10%FBS，IL-6的DMEM/F12 培养基（不含HAT或HT）。以后仅仅用含10%FBS 的培养基半量换液，不加HT。好像这里都不用HT，学校的试剂供应店只有HAT，没有HT。理由是杂交瘤耐受HAT, 随着换液浓度越来越低，对杂交瘤生长影响不大。一个人管10块板，特别是克隆和亚克隆阶段非常忙，加班加点是肯定的。因为我们要分析蛋白的抗原决定簇，所以全部阳性克隆都要亚克隆。当然忙不过来时，先冻存起来，以后再克隆。克隆和亚克隆时，血清的质量和浓度很重要，特别是没有饲养细胞时，但不是绝对的。因杂交瘤建立起来后生命力很强。血清不好可以加多一些细胞，开始克隆时不追求单细胞孔。亚克隆时再降低细胞浓度至1或0.1个细胞/孔。 我没有比较不同浓度血清对克隆或亚克隆的影响。我们的抗原都有纯化的天然蛋白，在制备构象决定簇抗体时，用天然蛋白免疫或DNA免疫，得到抗构象决定簇抗体的机会多。如用变性（通常热变性）蛋白免疫，而筛选用天然蛋白，得到序列决定簇抗体的几率大。当然不是绝对的。Dawn_grace
提到细胞株对IL-6的依赖性，只有试过才知道。不过细胞株之间差别很大，很难弄清原因，一般按经验处理。需要饲养细胞就加饲养细胞。也可以适应性培养，花的时间长一些。感谢ningbo57战友的精彩回复！HT我也是不用的，感觉影响不大。我用的也是ELISA筛选，一般铺3-5块板，但就这样感觉工作量也是不小的，很重要的一个原因就是孔里的细胞状态并非一致，有的生长快，有的慢，所以几乎每天都得做检测，有时一天两次。您提到“当然忙不过来时，先冻存起来，以后再克隆。”不知道一般是怎么操作的，是直接冻，还是扩大培养后再冻？如果是直接冻，会不会因为细胞数量太少，难以复苏？如果扩大培养，会不会造成抗体分泌能力丢失的现象发生？当时做的单抗主要是用来做血清学检测用的，没有做“分析蛋白的抗原决定簇”这方面的工作，但很有兴趣了解。可以简要谈谈这方面的工作吗？DNA免疫时效果稳定吗？我也看到过这方面的报道，实验有人做过DNA免疫，但抗体效价不高。不知道您在操作中可有什么值得借鉴的经验？大家都来谈谈哦，别让帖子沉了下去！一般先在24孔板扩增，继续阳性再冻存。你说的丢失的可能性是对的。所以尽量做克隆。初次克隆时一个偷懒的办法，不数细胞，根据经验直接克隆 ，一块板上做三种稀释度，10，3，1个细胞/孔。先保证有阳性孔，亚克隆时再做单细胞克隆。所以先按孔内细胞的多少，计数并确定稀释度，作为参考。我们的蛋白（已有1.8A X线晶体模型）先做了病人血清抗体识别的线性决定簇的分析（重叠系列多肽分析）。单抗主要分析构象决定簇。得到的单抗先用变性抗原筛选可能的构象特异性的单抗。再用噬菌体多肽展示分析可能的识别区域或序列，最后用点突变进一步证实。由于确定复杂构象决定簇的方法，就我所知都不理想，只能推测可能性。不知版主有何研究，请予帮助指教。谢谢！！另DNA免疫产生抗体反应，已有很多报道证实。但具体做时，只能根据免疫效果。通常最后用蛋白加强免疫一到两次。我有一株麻疹病毒的单抗，但是不知道他的抗原位点，我曾经做过WESTERN-BLOT，但是没有杂出任何特异性的条带，但ELESA是阳性，是不是这就说明我的单抗是识别构像表位的呢？另外，还想问一下楼主，现在最新的单抗技术，听说最新的技术只要70－80天就可以完成，不知道可否提供这方面的信息另外，还想问一下楼主，现在最新的单抗技术，听说最新的技术只要70－80天就可以完成，不知道可否提供这方面的信息请问ningbo57，我们也是苦于制作单抗周期太长，有没有办法缩短免疫时间呢（脾内免疫？），我也知道有人用抗体库筛选，但听说这样做出来的抗体亲和力不高。希望指教tingjiang wrote:我有一株麻疹病毒的单抗，但是不知道他的抗原位点，我曾经做过WESTERN-BLOT，但是没有杂出任何特异性的条带，但ELESA是阳性，是不是这就说明我的单抗是识别构像表位的呢？有可能。你可以在已经包被抗原的酶标板上分别用3M和6M的盐酸胍（Guanidine Chloride)室温处理半小时，洗后按常规做ELISA。最好有系列稀释。比较没有处理的孔与处理孔间的读数曲线差异。如6M处理后读数下降很多或接近本底，此单抗识别的多半是构象决定簇。单抗制备周期我觉得要辩证的看待。3-6个月能拿到有用的抗体，都算是正常。花的时间主要是免疫动物和融合筛选克隆两大块。从免疫的角度来看，免疫时间长一些，抗体的亲和性会高一些。动物间有个体差异，多免疫几只动物，从中选反应最好的做融合。脾内内免疫通常在抗原来源有限时用，或量少或纯化难，直接用转到硝酸纤维膜上的蛋白条带插在脾背膜下。也有人尾静脉注射无把握，最后加强时用。单纯求快，做出几个没有太大用途的抗体，除了应付交账外，没有什么意思。反而是耽误时间，还得重做。融合后到克隆建立倒是有很多技巧，节省很多时间。如有公司提供含甲基纤维素的HAT培养基，在平板培养筛选。待克隆长到肉眼可见时，用毛细管吸出，转到96孔板培养筛选。阳性孔就认为是已经克隆化了。因此融合后一个月内就可拿到抗体。至于这样的克隆有多纯，值得怀疑。噬菌体抗体库筛选抗体，主要的问题如你所说是亲和性太低。好像目前没有大的突破。特别是非免疫的抗体库。甲基纤维素的HAT培养基不知道ningbo57 有没有用过，现在可以提高克隆效率的还有那些方法呢？原理都是什么，可否详细谈谈！请问ningbo57甲基纤维素的HAT培养基这里用的是固体培养基吗？要不怎么能用毛细管吸出呢？我也来说几句。说来惭愧，以前我们一直在为国外的抗体厂家做OEM，然后等着人家贴完牌后在销售给我们。另一方面，国内的科研往往总是模仿和抄袭，很少有人自主从头研发新的基因、蛋白，因此市场较小；而且大家在发表文章时还常常以使用进口试剂为荣。虽感无奈但现实的确如此，谁让我们的国产厂商没有出息不争气呐！！！抗体生产虽然简单，但直到今天仍然没有我们自己的知名品牌！质量也不被人认可，钱被人拿走还是小事，产权的出让和品牌的丧失才是真正令人心痛的！个人认为好的单克隆抗体的价格应该在300-500元（一个包装，100ug）左右，而现在进口抗体售价常常在元，我们认为这个价格一定会在自主品牌诞生后大幅下降，而今天，没有发言权的我们只有选择接受和沉默！从去年底开始，我们决定建立自主的抗体品牌，之后慢慢出现了一些国内抗体定做的订单，我们在为国内科研界的进步和对自主产权抗体认识的加深感到欣慰的同时，也决定当老师们愿意接受我们的抗体并发表文章时，我们会有不同程度的鼓励。我们力量很小，钱也很少，也就是做些力所能及的事情，希望提升我国在抗体品牌方面的国际地位尽自己的一点微薄之力！>首先，十分感谢ningbo57 的分析，这样的话我还可以坚持按我们目前已经建立好的平台来做抗体，不然我就没有信心了！总觉得别人做的很快，而我们还在用传统的方法啊。其实现在想想我们做的单抗周期虽然长些（主要是免疫的时间长，筛选还好），但抗体的质量是不错的，有好多可以用于ELISA kit和WB及其它用途。另外，我也觉得cgydhw 说得很有道理，但是没有办法，目前国内的学术界就是这样，用国产的抗体即使做出好的结果，也怕国外杂志不认可，真是很无奈啊！但很遗憾，我们也主要是在重复国外已有的工作。并且，据我所知，国内好像没有那家企业有这样的实力，如果你知道一定要告诉我，我可以去打工哦！对了，还有一个问题请教。有没有只用ELISA方法来判断抗体亲和力的方法呢（我们这条件有限，做ELISA比较方便些；而且，我也不需要特别精确的方法，只要能做两株或多株抗体间的相互比较就行了）。比如说，我在测定抗血清效价时会有这样现象，1＃小鼠在1：1000数时，OD值较高，但随着稀释倍数增加，很快就降了下来；而2＃小鼠1：1000时可能不高，但OD值随着稀释倍数的增加，下降缓慢，我可以认为2＃小鼠产生的抗体亲和力高于1＃吗。我知道有一种把抗原抗体倍比稀释的矩阵ELISA法可以测定抗体的亲和力，有没有更简便的方法呢。dawn_grace wrote:对了，还有一个问题请教。有没有只用ELISA方法来判断抗体亲和力的方法呢（我们这条件有限，做ELISA比较方便些；而且，我也不需要特别精确的方法，只要能做两株或多株抗体间的相互比较就行了）。比如说，我在测定抗血清效价时会有这样现象，1＃小鼠在1：1000数时，OD值较高，但随着稀释倍数增加，很快就降了下来；而2＃小鼠1：1000时可能不高，但OD值随着稀释倍数的增加，下降缓慢，我可以认为2＃小鼠产生的抗体亲和力高于1＃吗。我知道有一种把抗原抗体倍比稀释的矩阵ELISA法可以测定抗体的亲和力，有没有更简便的方法呢。可以参考以下几篇文章，找到最适合你实验室的方法。1）李革,熊杰,刘志峰.巨细胞病毒特异性IgG抗体亲和力测定及其临床意义.中华实用儿科杂志,):162-4.2）傅思武,周殿元,赖卓胜,等.抗艰难梭菌毒素A单抗的制备及特性分析.细胞与分子免疫学杂志,):376-8.3）王刚垛,鱼涛,马兆扬,等.甲基对硫磷单克隆抗体的研制及鉴定.中华劳动卫生职业病杂志,):265-7.4）朱勇,金伯泉,刘雪松.用生物传感器测定抗重组α 2a-干扰素单克隆抗体的亲和力及抗原识别表位.中国免疫学杂志,):322-4.谢谢大家的讨论。就我所知对大家的问题集中在这里回答。我们曾经用过Hyclone的含1%甲基纤维素的HAT培养基，37C度下是胶冻状或半固体状。克隆长成肉眼可见时，用细的加样头吸出。含1%甲基纤维素的培养基先是用于做病毒空斑试验，起限制病毒自由扩散的作用。同样可以限制杂交瘤集落的扩散。在融合筛选克隆阶段，在提供充足营养的前提下，如何让单个细胞长成集落且不污染其他克隆来的细胞；并尽早让这样的集落扩增建立克隆，可能是理想状态下建立克隆所需的最短时间。因此，融合后种板时原则上是细胞浓度越稀越好，尽可能让一个孔只有单个杂交瘤细胞生长。但这样势必增加培养基，培养板的消耗，增加筛选的工作量和试剂消耗。需要一个可以接受的平衡点。在有充足筛选能力时，融合后接种到多块96孔板（以30-50%的孔有杂交瘤生长为度）较好。在有显微细胞操作仪的条件下，接种到多块24孔板也行。有限稀释法的缺点是将已形成克隆的杂交瘤集落全部打散，从单个细胞再花10-14天重新长成可检测的集落，大部分时间花在了这一过程上。用甲基纤维素培养基或用显微细胞操作仪挑选已形成的集落扩增，筛选和建立克隆，就是想避免从单个细胞长成集落的过程，从而节省时间，缩短周期。对于初步建立大量杂交瘤克隆供筛选用，这些策略和操作是好的选择。但对有价值的杂交瘤，可能还是需要进行单个细胞克隆，如有限稀释法或流式细胞仪或显微细胞操作仪法，确保单一细胞克隆。由于字数限制，接着再说。普通ELISA只能估计单抗的亲和力（又称功能亲和力性或亲合力）。在单抗蛋白浓度相同的情况下，滴度高的亲和力高。看了cgydhw 贴，有些感触。制备单抗，只是单抗研发过程中的一重要环节。发现靶抗原（包括蛋白的分离纯化，测序和功能确定等）和对单抗的鉴定，包括一般性质，识别的决定簇和功能的鉴定，花费的时间和投资更多，是单抗知识产权中更重头的部分。人家提供抗原，你制备出单抗，也就只能是收取制作费用（类似加工费），知识产权还是人家的。如果没有研究基础，很难获得单抗的知识产权。如果要分层次，我想最高层次是有全部知识产权，从靶抗原的发现到有用的单抗制备，功能鉴定和应用，全部是你完成的。其次，如果靶抗原是人家发现和确定功能的，你制备出有用的单抗并完成功能鉴定和应用，你可以有单抗部分的知识产权。再次，模仿制备出与人家有用的抗体相似或相同的单抗，你有所制备的单抗的知识产权；如果人家没有专利保护或专利过期，你还可以商品出售你的抗体。在国内目前薄弱的生物医学科研基础上，可能模仿制备人家的抗体是一条捷径。如果你有足够的证据表明你的抗体与商品抗体功能上是一样的或相似的，国内科研界还是会接受的。毕竟价格便宜是有杀伤力的，谁不愿意用物美价廉的产品呢？问题是你有能力模仿出来吗？ningbo57 wrote:看了cgydhw 贴，有些感触。制备单抗，只是单抗研发过程中的一重要环节。发现靶抗原（包括蛋白的分离纯化，测序和功能确定等）和对单抗的鉴定，包括一般性质，识别的决定簇和功能的鉴定，花费的时间和投资更多，是单抗知识产权中更重头的部分。人家提供抗原，你制备出单抗，也就只能是收取制作费用（类似加工费），知识产权还是人家的。如果没有研究基础，很难获得单抗的知识产权。如果要分层次，我想最高层次是有全部知识产权，从靶抗原的发现到有用的单抗制备，功能鉴定和应用，全部是你完成的。其次，如果靶抗原是人家发现和确定功能的，你制备出有用的单抗并完成功能鉴定和应用，你可以有单抗部分的知识产权。再次，模仿制备出与人家有用的抗体相似或相同的单抗，你有所制备的单抗的知识产权；如果人家没有专利保护或专利过期，你还可以商品出售你的抗体。在国内目前薄弱的生物医学科研基础上，可能模仿制备人家的抗体是一条捷径。如果你有足够的证据表明你的抗体与商品抗体功能上是一样的或相似的，国内科研界还是会接受的。毕竟价格便宜是有杀伤力的，谁不愿意用物美价廉的产品呢？问题是你有能力模仿出来吗？说得好，这正是国内抗体产业所面临的瓶颈和疑难所在，抗体行业看似简单，实际上如果达到完全的知识产权还是有相当的距离，我们希望这一过程在诸多有识之士的共同努力下能尽量缩短。这也正如同80，90年代的彩色电视机行业，从代工到模仿，从模仿到规模化，从规模化到创新。这两天忙的没时间上网啊。真要谢谢ningbo57 和cgydhw 的解释和帮助。看来中国的抗体事业还有很长的路要走啊。希望我们都能在其中尽自己的一份力量。最近我的大老板让我作单抗，我害怕一直没敢做，现在看到你的帖子，感到作这方面的工作确实很难，也很难出成果，不知道做这方面能不能博士毕业。不过现在值得庆幸的是还有你们几位高手在这里交流自己的经验，将来有问题就可以直接向几位请教，到时候请不要吝啬呀。我从事科研工作已经８年了，在这几年中我感到你们的这种交流在一个实验室中都很难进行，现在能够在网上进行公开交流，确实感谢你们，你们的这种行为真是值得推广，而且如果大家都能够向你们几位这样，国内的学术会有很大的进步。再次感谢taddybear :只做一个单抗就可以博士毕业好像是十年以前的事情了！其实我觉，就像我们在前面讨论时说的，抗体（无论是单抗还是多抗），只是一个工具，重要的是你用这个工具去做什么，抗原的特征是什么，用这个抗体可以研究抗原的哪些功能。还有就是，单抗的制备过程在国内也已经很成熟了，虽然刚开始做时还是会有些困难，不过，有这样的平台，应该没问题。我想问一下鼠单克隆抗体经人源化改造后的嵌合抗体转到小鼠骨髓瘤细胞 后，大量生产抗体时能够用小鼠体内诱生法生产吗我想问一下鼠单克隆抗体经人源化改造后的嵌合抗体转到小鼠骨髓瘤细胞 后，大量生产抗体时能够用小鼠体内诱生法生产吗我想问一下鼠单克隆抗体经人源化改造后的嵌合抗体转到小鼠骨髓瘤细胞 后，大量生产抗体时能够用小鼠体内诱生法生产吗原则上是可行的。细胞融合后杂交瘤细胞生长缓慢或是说不长,请问这是怎么回事?有没有好的解决办法?谢谢!我想请教一个问题：我现在用细胞作为抗原免疫动物，已经做过一次融合了，当时效价是1：4000，但是没有成功。现在又在免疫动物，但是经过三次加强之后，效价很低，可以说几乎是没有。现在很困惑不知道是什么原因。所以现在想请大家帮帮忙，有谁做过类似的单抗，希望给我一些指教，先 谢谢大家了。你用什么细胞免疫的?又是用什么方法评价免疫效果的?筛选用什么方法呢?我用的是一种肿瘤细胞作为抗原，然后再作ELISA时提肿瘤细胞的总蛋白进行包被测定效价。有谁能帮我解决一下:我刚刚做完融合不久 ,现在大约有8天左右. 以前我也做过融合,还有实验室其他人做过 ,都是在融合后的2,3天后孔内的细胞就基本全死了.但是这次不知道是为什么,孔里有很多特别大的圆的细胞不死,好象还有增殖现象.(以前从来没遇到过这种情况)孔里看不到克隆集落,好象也没有克隆生长.请问大家是不是我的饲养细胞浓度过大啊 ,如果是这样我该怎么办啊???????????
您的位置： &&两种主要单抗制备技术的比较
（资料来源：百特美博公司网站，）
同的技术平台，其一为经典的杂交瘤技术平台，其二为相对较新的噬菌体呈现抗体库技术平台。下面将对基于此两种技术平台的单抗定制进行简单的比较和分析。
一、 基于杂交瘤技术的单抗制备
&杂交瘤技术是在上世纪七十年代发展起来的一种抗体制备技术。杂交瘤技术发展到现在，已经相当成熟，主要包括以下几个环节：动物免疫（通常免疫小鼠）
--& 取动物的脾细胞或淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合 --& 筛选识别抗原的单克隆杂交瘤 --&
利用筛选到的杂交瘤生产单克隆抗体。
杂交瘤技术是一种很有效地单抗制备技术，已成功地应用于制备各种检测用抗体和治疗用抗体，国内外很多高校及研究机构都建立了基于杂交瘤技术的单抗制备平台。但是，近四十年的杂交瘤技术的应用经验也表明，利用杂交瘤技术进行单抗的制备似乎更适合手工作坊式的生产方式，而很难真正实现流水线式的工业化生产。这主要是由于杂交瘤技术本身的环节多，细节复杂，对人的技能依赖程度高。这些原因不仅导致该技术难于实现工业化，也导致基于该技术的单抗制备的成功率低。事实上，低成功率（70%或更低）是目前基于杂交瘤开展单抗定制服务领域的一个普遍现象。正是由于杂交瘤技术发展比较成熟，而且技术门槛比较低，目前国内几乎所有的单抗定制服务都是基于杂交瘤技术平台，不同的单抗定制服务商只是在某些具体环节上稍有差异，其整体服务水平（包括定制周期，成功率等主要技术参数）并没有显著的差异。
二、基于噬菌体呈现抗体库技术的单抗定制
噬菌体呈现抗体库技术平台是在上世纪90年代初步发展和成熟起来的一个单抗制备技术平台，其基本步骤包括：构建大容量高质量抗体库--&将抗体库呈现在噬菌体表面--&利用目的抗原对抗体库进行高通量筛选--&阳性单克隆鉴定--&利用哺乳动物细胞表达系统制备重组抗体。
与杂交瘤技术不同，利用噬菌体抗体库技术来制备抗体的技术门槛较高，涉及多种高新生物技术的综合应用，包括：大容量抗体库的构建技术，噬菌体呈现及高通量筛选技术，基因工程抗体技术，哺乳动物细胞高表达技术等。因而传统的抗体定制服务商很难顺利搭建出一个的基于噬菌体呈现抗体库技术的服务平台。正是由于噬菌体呈现抗体库制备单抗的这些特点，当前，国际上几个知名的掌握抗体库技术的的公司（如MorphoSys
AG, MedImmune, Dyax等）都专注于抗体药物的研发。直到2013年，Bio-Rad公司购买了Morphosys
AG的子公司AbD Serotec ，首次开始利用其HuCAL抗体库开展单抗定制服务。
事实上，一旦跨过了噬菌体呈现抗体库技术的高门槛，成功建立基于噬菌体呈现抗体库技术的单抗制备平台，则单抗定制服务将会变得更快捷，更可靠（具体见下表）。
附表：两种技术平台在单抗定制服务方面各种参数的比较
抗体库技术
杂交瘤技术
8---10周（2---2.5月）
17---26周（4-6月）
抗体特异性
可依客户需要定向筛选
可依客户需要制备成
人抗体或鼠抗体
可方便进行亲和力成熟
可直接提供抗体DNA序列，便于进行基因工程改造
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。研究型稳定细胞系构建+
哺乳动物细胞重组抗体表达概述
摘要：抗体的生产可通过不同的方式，哺乳动物细胞生产或刺激动物免疫系统生产，本文主要了介绍两者的生产方式和区别。
蛋白结构表面可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇（又称抗原表位见右图）。它一般由6-12个氨基酸或碳水基团组成，可以是由连续序列组成或不连续的蛋白质三级结构组成。一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇，因此，机体可以产生多种不同的抗体。由单一B淋巴细胞产生仅识别一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。由多种B细胞产生，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体称为多克隆抗体。单抗与多抗的区别可参考单抗与多抗的区别。重组抗体生产根据基因序列制备得到单抗，通过构建稳定表达细胞系满足对抗体量的生产。
重组抗体和免疫抗体制备
抗体的生产有两种方式。①利用重组蛋白的方式获取接近天然条件下的重组蛋白（或多肽），通过刺激动物免疫系统，最终获得抗体。②利用哺乳动物细胞生产，在已知抗体基因序列的前提下，将基因序列克隆到相应载体上，进行重组抗体的表达。刺激动物免疫系统可以生产单抗或多抗，这种方法成功率高且抗体效价较好。而通过序列进行，针对特定基因只能生产单抗。两种生产方式在作用原理和流程等方面都有一定的区别和联系，具体如下：
1.生产流程
哺乳动物细胞重组抗体生产
刺激动物免疫系统制备单抗
两种方式制备单抗综述
抗原的制备：通过刺激动物免疫系统生产单抗前提是要获得抗原，抗原可以是可溶性蛋白，多肽。可溶性蛋白通过重组蛋白生产得到。多肽作为抗原与载体偶联免疫小鼠，用多肽进行筛选，如不能进行抗体筛选，需偶联另一种载体进行筛选；
免疫动物：免疫动物一般选用6周龄的小鼠，根据自己制定的实验方案操作。用已经制备的抗原免疫小鼠，使其分泌B淋巴细胞，进行下一步的融合；
细胞融合：实验前准备好骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞与B淋巴细胞按照一定的比例融合，形成杂交瘤细胞；
杂交瘤细胞选择培养筛选：用HAT筛选①培养基筛选融合成功的杂交瘤细胞；
融合细胞的单克隆生长鉴定：采用有限稀释法或其他方法进行杂交瘤细胞的克隆培养，通过鉴定最终得到能够生产单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
哺乳动物重组抗体在以上流程的基础上进行
构建：对上述实验得到的抗体测序得到抗体的序列，利用哺乳动物细胞生产重组抗体的方式表达，筛选可稳定表达的细胞系。
单克隆抗体的大量制备：筛选出能够稳定生产的细胞系，满足后续对抗体的大量需求，节约后续实验时间。
2.制备单抗的原理
哺乳动物细胞重组抗体表达
传统的生产抗体的方式是用抗原刺激动物免疫系统，这种方式需先制备抗原，且利用这种方法生产抗体难以满足大量的生产（需求大量的实验耗材和时间）。而哺乳动物细胞生产抗体的方式有一定的优势。①已知抗体的基因序列，将序列克隆到表达载体上，导入到哺乳动物细胞体内培养，通过一系列的筛选简单最终获得能够稳定生产此抗体基因的稳定细胞系，这一过程需要大量的时间，才能筛选出足够稳定表达的细胞系，并能够在后续实验中稳定长期生产。②未知序列的抗体大量生产，先刺激动物免疫系统得到少量抗体通过测序得到抗体序列，通过筛选稳定表达的细胞系，满足大量生产需求。
刺激动物免疫系统制备抗体
制备抗原，用抗原刺激动物免疫系统，将抗原处理过的B细胞和骨髓瘤细胞融合，融合后的细胞既具有B细胞合成专一抗体的特性同时又能够无限增殖（B淋巴细胞不能再体外生长，应用杂交瘤技术可使其在体外无限增殖）。经过HAT筛选，体外培养融合成功的细胞或在体内腹水培养，单克隆生长，最终进行抗体检测。刺激动物免疫系统生产抗体需要制备抗原，抗原可通过重组蛋白生产的方式获得，通过先获得抗原再生产抗体。
HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理
细胞融合是一个随机的过程，融合后可能会出现的细胞有杂交瘤细胞，融合的脾细胞与脾细胞，融合的瘤细胞与瘤细胞，未融合的脾细胞，未融合的瘤细胞以及细胞多聚体。那么，如何才能筛选出杂交瘤细胞？对于正常的脾细胞，它在培养基中的存活期为7-14天，因此无需特别筛选，细胞的多聚体也容易死去，只有未融合的瘤细胞需要特别筛选除去。
选择培养基有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H），氨基喋呤（aminopterin，A），胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T），故称为HAT培养基。
细胞DNA合成有两个途径：
A.主要途径：由糖，磷酸，氨基酸，CO2，NH3等化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。而氨基喋呤是是叶酸的拮抗物，可以阻断杂交瘤和瘤细胞通过这一途径合成核苷酸。
B.应急途径：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷共同存在的情况下，经过次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）共同催化合成DNA。而瘤细胞是该两种酶的缺陷型，因此不能再HAT培养基上生长，不合成或不分泌免疫球蛋白，只有融合的杂交瘤细胞具有脾细胞和瘤细胞的遗传性能，可以通过应急途径合成DNA，在HAT培养基上长期存活，繁殖和分泌抗体。
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