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酪氨酸酶抑制剂IC50值的计算方法及其验证
优质期刊推荐11）除置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分；加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶；12）关于如何计算IC50方法有多种；(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(；(2)Bliss法:自己查阅书籍；(3)IC50计算软件，见下面附件；（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于；（5）在线求IC50或EC50：；13）计算抑制率，
11）除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，
加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。
12）关于如何计算IC50 方法有多种
(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
(2)Bliss法:自己查阅书籍
(3) IC50计算软件，见下面附件
（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！
（5）在线求IC50或EC50：
13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.
MTT试验的一些细节问题
1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞
数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线
性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，
可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细
胞增殖抑制表现的最明显）。
4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于
静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同
的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会
影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培
(二)实验步骤
贴壁细胞：
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞
调密度至孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个
复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，
再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分
溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓
度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
悬浮细胞：
1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌
水填充）。每板设对照（加100?(储存液100 1640）。
2.置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3.每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪
OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4.离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪
OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
(三)MTT的配制
MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管
里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当
MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕
竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
(四)关于细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进
口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性
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方法一：用寇氏改良法计算：
改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg&最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、&0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
方法二：SPSS计算法
&&&&运行SPsS&&进入SPSS数据编&辑器后，首先激活变量表(Variable
View)定义变量，&在变量名(name)下输入“剂量”、“动物数”和“死亡&数”，并将“剂量”的小数点位数(Decima1)设为“2”，&“动物数”和“死亡数”的小数点位数设为“0”。然后&进入数据表(Data
View)，根据表头提示，依次输入&各组数据(见图1)。
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图一（备注：图片中数据位MTT数据，从左到右依次为药物浓度、阴性组-实验组吸光度、阴性组吸光度）
1．2参数选择
在数据表主菜单中，选择Analyze（分析）-"Regression（回归）--"
Probit，调出Probit
Analyze对话框，只需将“剂量”选人“Covariates”（协变量）栏中，“死亡数”选人“Response
frequen—&cy”（反应频率）栏中，“动物数”选人“Total
observed”（观察总值）栏中，在&“Transform”（转换）栏中，选择“log base
10”（logbit）(以10为底的对&数转换)，其它保持默认选项(图2)。然后单击“OK”&钮即完成整个操作过程。
<img src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="/data/attachment/album//fo277awx44tj1z.jpg" STYLE="word-wrap: break- max-width: 620"
ALT="MTt法或者毒性试验&IC50计算方法"
TITLE="MTt法或者毒性试验&IC50计算方法" />
完成上述操作，SPSS会自动显示全部分析结果&(SPSS
Viewer)，其中包括：回归方程参数表(图3)，不同剂量的实验值和预期值概率表(图4)，从0．01到&0．99死亡率的剂量(包括0.50，即&&)及95％可信区间表。以及对数单位与概率单位的关系曲线。
可参考文献：用SPSS软件计算新药的LD50【药学进展&&2003年&第27卷&第5期】
方法三：origin拟合曲线
所需数据：剂量、吸光度平均值（MTT实验）
打开origin。一列输入&&剂量数据，一列输入吸光度平均值数据。如图：
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然后点击【tool】-【sigmoidal】--在出现的对话框中选择【fit】即可，在右下角的结果中&&lgIC50所对应的数值极为IC50所对剂量。如图
<img src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="/data/attachment/album//210838rtppebrsopyestbd.jpg" STYLE="word-wrap: break- max-width: 620"
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