为什么lncRNApcdna3.1测序引物要建链特异性文库？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-10-20 04:12 标签： pcdna3.1测序引物

刚接触高通量测序的时候就知道有链特异性建库这么个概念，当时也了解可以利用加U法，但是没有思考其中的细节。最近把这个概念掰开了揉碎了好好理解，终于填上了这个坑。 正式讲之前，有几个概念是要明确的。 DNA 的正链和负链，就是那两条反向互补的链。参考基因组给出的那个链就是所谓的正链（forword），另一条链是反链（reverse）。但是这正反一定不能和正义链（sense

链特异性文库，就是说链是由方向性的。对于普通的文库，测序的插入片段都是双链，但是链特异性文库是单链。通过在反向互补时添加特定的标记，在双链合成后，将第二条链去除，最后用于测序的就只有一条链了。如果一个...转换 种比对情况，对于链特异性的文库，只有C->T 转换，所以

下面通过这张建库示意图来看看普通RNA-Seq建库和链特异性建库的...知道测出来的reads是来自正链还是负链。 而链特异性建库（以图中间的dUTP方法为例）则是首先利用随机引物合成RNA的一条cDNA链，在合成第二条链的时候用dUTP代替dTTP，加adaptor后用

敏感性与特异性 一级目录 一级目录 感性和特异性虽然与查准率和查全率相似，但并不相同。其定义如下： 在癌症示例中，敏感性和特异性指： 敏感性：在患有癌症的所有人中，诊断正确的人有多少？ 特异性：在未患癌症的所有人中，诊断正确的人有多少？ 查准率和查全率的定义如下： 查准率：在被诊断患有癌症的所有人中，多少人确实得了癌症？ 查全率：在患有癌症的所有人中，多少人被诊断患有癌症？

简介： R环是一种特殊的染色体结构，由一条RNA：DNA杂合链和一条单链DNA所组成。 R-loop广泛存在于细菌、真菌、植物与动物的基因组中，在基因转录、DNA复制、表观遗传修饰以及DNA损伤修复... and sequencing DNA:RNA杂合链抗体的免疫共沉淀及高通量测序分析技术 DRIP-seq的缺点：包括检测信号的分辨率有限和S9.6抗体的特异性不足。 R-ChIP： 通过在细胞中表

文章来源：企鹅号 - Chris生命科学小站

很多时候翻翻生信技能树的帖子就能找到答案，比如下面的这个关于链特异性建库的讲解很详尽，今天翻出来给大家分享一下。

ps感谢小站的小伙伴迅子提供相关资料。

搞清楚是否为链特异性建库重要吗？

小站一直关注转录组原始数据的分析。原始数据下载的时候，有的会写清楚是否为链特异性建库，而很多时候是不写的，那么这个对于分析来说重要吗？具体讲清楚什么是链特异性建库这个事，实在是太难，大家可以去看那简书的内容。如果看完简书内容还是晕的话，那么听站长粗略的解释一下。你可以把链特异性建库看作是更高级的建库方法，所以

1、如果自己做测序一定要问清楚是否为链特异性建库，是哪种？因为非链特异性建库方法便宜，小小被坑。2、如果研究的是编码基因，看一个表达量变化，用非链特异性建库省点钱也是可以的。3、如果做的是lncRNA，环状RNA，那么一定要做链特异性建库测序。miRNA的建库方法本身就是链特异性的。那么从公共数据库下载的数据，如果不是链特异性的就不能分析lncRNA和环状RNA了吗？这个问题可能是大家最关心的。对于这个问题，下面是站长的答案，仅供参考！仅供参考！仅供参考！。本来原始数据就少，能分析就分析吧，所有分析出来的基因，肯定逃不过验证这一步。如果原始数据是链特异性建库，分析时候参数正确，在验证时候候选差异基因正确的概率更高一些。如果原始数据是非链特异性建库，候选基因在验证时候正确的概率稍低一些。但是只要经过生化试验验证，证据充分，其实跟是啥方法建库没啥关系。这也是，为什么纯生信文章不好发表的原因之一。一切证据还得有生化试验支持才算数。当然这只是从基因表达量的方面考虑，如果研究转录后修饰什么的，千万别这么搞哈~

公共数据怎么识别是不是链特异性建库

视频背景音乐：来自于奥戸巴寿的《いつも何度でも》视频中第二行样本是非链特异性测序，第三行样本是dUTP链特异性测序如下图

结合小站之前的教程这一步应该插在STAR Mapping之后随便选一个样本，在样本文件夹里找到bam文件，然后用samtools

再看是什么样的链特异性在链特异性那个样本右键选color alignments by read strand鼠标放在红或者蓝的read上，看信息。显示first of pair那个read的箭头方向与基因的方向相反

，这就提示是dUTP建库的方法。知道这些有啥用呢？非链特异性的要选第二列那个数而dUTP链特异性建库要选第四列那个数所以批量处理counts数教程中

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烈日炎炎，暑期将至，空调可以抵御高温的折磨，却抵挡不住派森诺众位客户的热情。目前派森诺转录组测序产品中，真核生物mRNA文库构建的方式有两种，分别是真核非链特异性转录组文库（又称普通转录组文库）和真核链特异性转录组文库，随着转录组研究的不断深入，真核链特异性转录组文库越来越受到大家的青睐。那么问题来了，什么是“链特异”？为什么选择“链特异”？何时选择“链特异”？

今天小编就带领大家一起细数一下“链特异”与“非链特异”文库的那些事，相信看完你就能找到答案。

01、什么是链特异性转录组测序？

RNA-seq）是指在构建测序文库时，将转录本的方向信息保存到测序文库中，测序后的数据分析可确定转录本是来源于基因组的正链或负链。与普通转录组测序相比，它更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，而这些反义转录本对基因的表达调控可能起非常重要的作用，此外还可能发现新的基因，对研究基因结构和基因表达调控都具有重要意义。

02、普通转录组文库和“链特异”文库区别

众所周知，DNA是双螺旋结构且具有正负链之分，通常将携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。简单来讲，“链特异”文库是以RNA反转录的cDNA一条链为模板进行PCR扩增构建的文库，而普通转录组文库是以RNA反转录的cDNA两条链为模板进行PCR扩增构建的文库。因此，普通转录组文库无法区分RNA极性，而“链特异”文库能够有效区分RNA极性，这就是两种文库的区别所在。

03、如何实现“链特异”建库？

与传统普通转录组建库相比，“链特异”建库在实验原理和操作步骤上又有何差异呢？目前，市面上“链特异”建库方法有多种，而小编使用的是最普遍的dUTP法，即在合成cDNA第二链时用dUTP代替dTTP，然后在PCR富集之前使用UDG将含有U的DNA链水解掉，这样就只有第一链保留下来，即可知道测序得到的转录本是来自于正义链还是反义链。话不多说，直接上图比较一下普通转录组建库和链特异建库的流程差异：

又称掺U法，首先使用常规的方法从RNA上逆转录出第一条cDNA链，然后在合成第二条cDNA链时，将加入的dNTPs中的dTTP替换为dUTP，使得合成出的第二条cDNA链中会掺入大量U碱基，随后在双链cDNA的两头接上接头，最后在PCR扩增阶段使用UDG酶特异性降解带有U碱基的cDNA链，从而保证得到的转录组文库保留其方向性。

尿嘧啶-DNA糖基化酶：Uracil-DNA Glycosylase，简称UDG，能够特异识别DNA链中的尿嘧啶碱基（U），并且把U碱基进行糖基化，随后将糖基化的U碱基从核酸链上切除，使核酸链上就生成一个缺碱基的空位，然后在脱碱基位点上降解核酸链，使得DNA不能再被DNA聚合酶复制，对RNA无活性，常被用于消除PCR扩增中的参与污染。

04、为何选择“链特异”文库？

从上面二者的操作步骤可以得知，普通转录组建库无法确定RNA的方向性，对于反义转录本的发现、新基因功能注释、基因结构分析及基因表达的精确计算均具有很大的限制，而“链特异”建库可以保留RNA的方向性，测序时可以确定转录本来源于基因组的正义链或反义链，能够很好的克服普通转录组测序的不足，基于此，链特异性建库具有比传统建库更多优势，包括：

（1）定量转录本表达量更精确

由于“链特异”文库可以保留RNA的方向信息，因此在计算某些转录本的表达量时，可以排除来自其互补链上的转录本表达的干扰，使得基因定量更精准。

（2）可变剪切事件检测更准确

链特异性文库可以排除反义链上转录本的影响，使可变剪接事件的假阳性率降低。已知circRNA由反向剪切形成，在发掘新的circRNA时，链特异性的测序方式有助于提高circRNA检测的准确率。

（3）提高非编码转录本的检出率，发掘潜在顺式天然反义转录本

反义转录广泛存在于真核生物中，且在发育、代谢等多种生物学过程中具有非常重要的调控作用。链特异性文库可以提高反义链上非编码转录本的检出率，同时也便于确定哪些位于基因间的非编码转录本的方向。

（4）更好预测原生生物操纵子（operon）

原核生物的基因为多顺反子结构，如果对正反义转录本上的基因不加区分，那么对应位置的基因表达量会计算不准确，对操纵子以及基因结构的预测也更不准确。“链特异”文库可更准确实现对操纵子鉴定与分析。

（5）转录本组装更高效、真实

普通转录组组装出来的unigene既包括编码转录本，也包括一些非编码转录本（如lncRNA），若不区分正反链，那么有互补配对关系的编码与非编码转录本会被组装成一条转录本，所以“链特异”文库可明确转录本的方向性，在进行无参转录本组装时显得很有必要。

05、何时选择“链特异”文库？

说了那么多，相信大家对链特异性文库已经有了系统的了解，既然链特异性文库有这么多好处，那么该何时将这些好处加以具体应用呢？为了更好地促进您的转录组研究，贴心的小编为大家整理了“链特异”文库应用方向的思路参考，若您的转录组研究涉及到以下几个方向（包括但不限于）：

（1）差异基因精准分析；

（2）原核生物操纵子分析；

（3）模式生物结构分析。

不妨果断选择派森诺真核链特异性文库，其优越的性能和广泛的应用定将不负所望！

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