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三七醇提物对大鼠肝组织体内外抗氧化作用的研究
胡军霞 海春旭 梁 欣
三七醇提物对大鼠肝组织体内外抗氧化作用的研究
三七醇提物对大鼠肝组织体内外抗氧化作用的研究
胡军霞/海春旭*/梁& 欣
( 第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室，陕西 西安& 710032 )
The antioxidative activities of panax notoginseng in rat livers& in vivo and in vitro
HU Jun-xia，HAI Chun-xu*，LIANG Xin
(Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032,
Shaanxi, China)
【摘要】 目的： 研究三七(panax notoginseng，PNG)醇提物对大鼠肝组织的体内外抗氧化作用。方法：采用羟自由基 (·OH)和超氧阴离子自由基 (O2-.)两种化学发光体系，观察三七醇提物对化学发光强度的抑制作用；采用过氧基异丙苯(cumene hydroperoxide， CHP)、维生素C(VC)/硫酸亚铁(Fe2+)和四氯化碳(CC14)/还原型辅酶Ⅱ(NADPH)作为激发剂，建立3种微粒体脂质过氧化(lipid peroxidation， LPO)损伤模型，观察三七醇提物对丙二醛(MDA)生成的抑制作用。用60 Coγ射线辐照大鼠建立氧化损伤模型，观察三七醇提物对肝组织的氧化型谷胱甘肽(GSSG)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶 (CAT)含量及活性的影响，以及对MDA生成的抑制作用。 结果：在两种化学发光的体系中，三七醇提物对O2-.和·OH的抑制率均显著高于阴性对照组(P&0.05)，且呈明显剂量-效应关系，三七醇提物对O2-.和·OH的IC50分别为1.25和0.625 mg/ml；3种LPO损伤模型中三七醇提物不同浓度组的MDA含量均显著低于对照组 (P&0.05)；在体大鼠氧化损伤模型实验的肝组织中，三七醇提物不同剂量灌胃组[(50、225和450 mg/(kg·d)]， 其MDA的含量均较阳性对照组(仅做60 Coγ照射)降低(P&0.05)；225和450 mg/ (kg·d)剂量组CAT活性较阳性对照组显著升高(P&0.05)；其450 mg/(kg·d)剂量组SOD的活性较阳性对照组显著升高(P&0.05)；而225和450 mg/ (kg·d)剂量组GSSG含量较阳性对照组显著降低(P&0.05)。 结论：三七醇提物对体外氧化损伤模型具有很强的抗氧化作用，对辐射引起的大鼠体内肝脏氧化损伤具有一定的抗氧化修复功效，并呈剂量-效应关系。
【关键词】 三七；辐射；抗氧化；微粒体模型；自由基
&中图分类号： R931.6&&&&& 文献标识码： A&&&&& 文章编号： 11)03-0171-06&&&&& doi: 10.3969/j.issn.11.03.003
【ABSTRACT】 OBJECTIVE: To study the antioxidative activities of the ethanol extract of panax notoginseng (PNG) in several free radical models in vitro and in oxidative damage rat model in vivo. METHODS：The chemiluminescence systems models for determination of& hydroxyl radical (·OH) and superoxide anion radical (O2-. )were built to observe the inhibitory rates of luminous intensity by different concentrations of PNG extract.& The microsomal lipid peroxidation model stimulated by CHP，VC/Fe2+ and CC14/NADPH were established to observe the inhibition of MDA by different concentrations of PNG extract. The oxidative damage rat model& was built by 60Co-γray to observe the inhibitory effect of PNG extract on the generation of MDA and GSSG， and& the changes of CAT and SOD activities& in livers. RESULTS： In the two chemiluminescence systems， the inhibitory rates of ·OH and O2-. by PNG extract were significantly higher than that in control group， with significant dose-effect relationship. The IC50 of O2-. and ·OH by ethanol extract of PNG were 1.25 mg/ml and 0.625 mg/ml， respectively. Compared with that in control group， the content of MDA in the three LPO models decreased significantly (P&0.05) at different concentrations，with a dose-effect relationship. After PNG oral administration， decrease of MDA was observed in rat livers.& The activities of SOD and CAT were increased by ethanol extract，the content of GSSG was decreased by ethanol extract.& CONCLUSION：In several& in vitro and in vivo models described above， the ethanol extract of PNG& demonstrated effective antioxidative effects and revealed a dose-effect relationship.
【KEY& WORDS】 panax notoginseng ；radiation；antioxidation activity；microsomal lipid peroxidation models； free& radical
三七为五加科植物， 是我国传统中药材，其根、茎、叶、花均可入药，主要药用部位是块根。具有散瘀止血、消肿定痛作用，用于各种内、外出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛。苏雁涛等[1] 认为三七具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及延缓衰老等作用。研究证明三七中主要活性成分为三七皂苷，具有保护心肌缺血作用，具有“参中之王”的美誉。有研究显示，三七皂苷有一定的抗脂质过氧化作用。随着三七应用的不断扩展，近年对三七皂苷的研究越来越多，陈锡文等[2] 认为三七对辐射损伤有一定的保护作用。但是，以往研究选用氧化损伤模型比较单一，不能充分反映体内外的变化情况，因此本研究选择多种体外模型，并与体内模型进行了对比研究，进一步观察三七醇提物对体外体内氧化应激模型的损伤修复作用。
1& 材料与方法
1.1.1& 仪器与试剂&& 3K30型台式高速冷冻离心机为美国Sigma公司产品；7200型光栅分光光度计为尤尼柯产品，IFFME型流动注射化学发光分析仪为西安瑞迈分析仪器有限责任公司产品。硫代巴比妥酸、黄嘌呤氧化酶 (xanthinoxidase，XO)、黄嘌呤、过氧基异丙苯(cumene hydroperoxide，CHP)、鲁米诺、还原型辅酶II(NADPH)、& 丙二醛 (MDA)标准品均为德国Merck公司产品；碳酸钠、碳酸氢钠、三羟甲基氨基甲烷(trisaminomethane， Tris)、冰乙酸、三氯乙酸、乙醇、抗坏血酸、蔗糖、硫酸亚铁、CoC12、CC14、H2SO4、KC1、磷钨酸、硼酸等均为国产分析纯试剂。
1.1.2& 实验动物&& 雄性Sprague Dawley (SD)大鼠50只，清洁级，体质量180~220 g，由第四军医大学实验动物中心提供。
1.2.1& 三七醇提物的制备&& 取200 g三七，分2次置于乙醇提取回流装置中，按100 g三七加入800 ml的比例加入无水乙醇，水浴加热回流2 h，滤出提取液，三七药渣再经同样比例无水乙醇回流2 h，合并两次回流液，置于旋转蒸发仪中回收乙醇，待回收乙醇后的提取物的比重在1.5左右时，取出，置于80 ℃烘箱烘干，粉碎后备用。
1.2.1& 微粒体的制备[3]& 10只SD大鼠禁食24 h，颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗去血污，滤纸拭干，按每克肝湿质量加入4 ml蔗糖Tris/HCl 缓冲液(250 mmol/L，pH=7.4)，用电动匀浆器制成匀浆液。操作全过程在0~4 ℃下进行。采用低温超高速离心法提取肝微粒体，-20 ℃保存。使用时按每克肝湿质量用1 ml的0.15 mol/L KCl悬浮。采用Lowry’s法测定蛋白含量。
1.2.2& O2-.化学发光体系的建立&& 参照文献[4]的方法进行。
1.2.3& ·OH化学发光体系的建立&& 参考文献[5]的方法进行。
1.2.4& 微粒体CHP脂质过氧化(lipid peroxidation，LPO)激发模型的建立&& 参照文献[6]的方法进行。
1.2.5& 微粒体VC/Fe2+ LPO激发模型的建立&& 参照文献[6]的方法进行。
1.2.6& 微粒体CCl4/NADP LPO激发模型的建立&& 参照文献[7]的方法进行。
1.2.7& 动物分组及处理& 40只大鼠按体质量均衡原则随机分为阴性对照组、阳性对照组、三七醇提物的不同剂量组 [分别为50、225和450 mg/(kg·d)]，共5组，每组8只。阳性对照组大鼠给予 剂量3 Gy、距离80 cm、剂量率278.89 cGy/min& 60Coγ照射，并隔日给予同样剂量照射，照射2次，累计照射剂量6 Gy；三七醇提物组大鼠辐照剂量和步骤与阳性对照组相同，在照射前3 d及照射后7 d分别灌胃给予相应剂量三七醇提物，阴性对照组仅给予等容量生理盐水。各组动物饲喂普通饲料，正常饮水。第11天禁食12 h后戊巴比妥麻醉，解剖取肝脏进行有关指标测定。
体外自由基激发模型实验设为阳性对照组和不同三七醇提物浓度组(0.156 25、0.625、2.5、10.0 mg/ml)， 具体方法同上述。
1.2.8& 丙二醛的测定& 采用八木国夫法测定硫代巴比妥酸反应物 (thiobarbituric acid-reactive substance， TBARS) 的含量[8]。原理为：丙二醛 (malondialdehyde， MDA)作为过氧化脂质的降解产物，可与硫代巴比妥酸 (thiobarbituric acid， TBA)结合形成有色物质。此物质若以515 nm为激发光，则在553 nm处有最强荧光强度，故可用荧光分光光度计进行微量测定。
1.2.9& SOD活性的检测&& 采用改良盐酸羟胺法[9]测定总SOD活性。取储存的肝组织按1∶4匀浆20 μl，稀释至100 μl，按表1自上而下的顺序依次加入试剂。
当加入NH2OH·HCl后，立即计时，置于37 ℃恒温水浴中避光反应10 min，用2.0 ml甲酸准时终止反应，于560 nm测定吸光度值D(560)。酶单位定义为：在本实验条件下，SOD抑制率达50%，所对应的样品活性即为一个SOD 单位 (U)，以每克蛋白 (U/g)表示。计算公式为：
1.2.10& 过氧化氢酶(catalase，CAT)活性检测&& 采用过氧化氢酶测定试剂盒(南京建成生物公司)测定样品中CAT的活性。具体操作参照试剂盒说明书。
1.2.11& 氧化型谷胱甘肽含量测定&& 在pH为12的条件下，邻苯二甲醛 ( phthaldialdehyde，OPT)可以与氧化型谷胱甘肽 (oxidizedglutathione，GSSG) 特异地结合形成GSSG-OPT，该物质在一定的激发波长(337.8 nm)和发射波长(421.6 nm)下可进行微量荧光测定，从而间接对GSSG 进行测定[10]。N-乙基马来酰亚胺 (N-ethylma leimide，NEM)能与还原型谷胱甘肽 (glutathione，GSH) 络合，从而防止GSH在氧暴露的条件下被氧化为GSSG，可用来消除GSH转变为GSSG 对实验测定结果的干扰。
1.2.12& 蛋白含量测定& 采用Lowry’s法[11]测定样品中蛋白含量。
1.2.13& 统计学方法& 实验数据采用SPSS 11.5 for windows 统计分析软件进行线性回归分析和方差分析，应用Dunnet t 检验进行组间的两两比较。以α=0.05为检验水准。
2.1& 三七醇提物对·OH化学发光体系的影响
与阴性对照组相比，在0.315~10 mg/ml的范围内，三七醇提物显著抑制了·OH的生成 (P&0.05)。且随着提取物浓度的提高，抑制率逐渐升高 (图1)。根据测得的已知样品浓度的抑制率拟合曲线方程，计算三七醇提物对·OH的IC50为1.25 mg/ml。
2.2& 三七醇提物对O2-.化学发光体系的影响
与阴性对照组相比，在0.315~4 mg/ml的范围内，三七醇提物显著地抑制了O2-.的生成 (P&0.05)。且随着提取物浓度的提高，抑制率逐渐升高 (图2)。根据测得的已知样品浓度的抑制率拟合曲线方程，计算三七醇提物对O2-.的IC50为0.625 mg/ml。
2.3& 三七醇提物对CHP激发的LPO损伤模型的影响
与阳性对照组相比，三七醇提物各不同浓度实验组的MDA含量均显著下降 (P&0.05，表2)，且随着浓度的增加呈一定的剂量-效应关系。
2.4& 三七醇提物对VC/Fe2+ 激发的LPO损伤模型的影响
与阳性对照组相比，三七醇提物不同浓度实验组的MDA含量均显著下降 (P&0.05，表3)，且呈剂量-效应关系。
2.5& 三七醇提物对CC14/NADPH 激发的LPO损伤模型的影响
与阳性对照组相比，三七各不同浓度实验组的MDA含量均显著下降 (P&0.05，表4)。且随着浓度的升高呈现一定的剂量-效应关系。
2.6& 肝脏相关抗氧化指标的变化
2.6.1& 肝组织中总SOD活性的变化& 阳性组SOD活性与阴性对照组相比，差异无统计学意义 (P&0.05)，给予不同浓度的三七醇提物后，SOD活性在50 mg/(kg·d)剂量组降低，225 mg/(kg·d)剂量组升高致接近对照组水平，50和225 mg/(kg·d)剂量组与阳性对照组比较差异均无统计学意义；450 mg/(kg·d)剂量组的SOD活性显著升高，与阳性对照组比较差异有统计学意义 (P&0.05)， 见图3。
2.6.2& 肝组织中MDA含量变化& 照射后，阳性对照组肝组织匀浆液中MDA含量明显高于阴性对照组 (P&0.05)。三七醇提物组MDA含量降低，随着三七醇提物浓度的增加，MDA含量逐渐降低，呈剂量-效应关系。其225和450 mg/(kg·d)剂量组较阳性对照组明显降低 (P&0.05)。见图4。
2.6.3& 肝组织中CAT活性变化& 阳性对照组肝组织匀浆液CAT活性有一定程度升高，但与阴性对照组间差异无统计学意义 (P&0.05)。不同浓度三七醇提物组的CAT活性随着剂量增加有一定程度的升高，且呈剂量-效应关系，而225和450 mg/(kg·d)剂量组CAT活性显著高于阳性对照组 (P&0.05)，见图5。
2.6.4& 肝组织GSSG含量变化& 阳性对照组肝组织匀浆液中GSSG含量显著高于阴性对照组 (P&0.05)，三七醇提物不同浓度组随着三七醇提物剂量的增加组织匀浆液中GSSG含量降低，呈剂量-效应关系，225和450 mg/(kg·d)剂量组与阳性对照组相比其差异具有统计学意义 (P&0.05)。见图6。
三七在临床上已被广泛应用，高云涛等[12]发现三七总皂苷具有良好的清除自由基和抗氧化能力。陈芝云等[13]推测三七能够清除过多的自由基，阻断氧自由基介导的脂质过氧化反应，阻止脂质过氧化物的产生，从而阻止肝细胞损伤。
本研究检测了三七醇提物在体外、体内的抗氧化性。化学发光是一种间接检测自由基的方法。化学发光实验结果显示，三七醇提物对化学发光有明显的抑制作用，并存在剂量-效应关系，说明三七醇提物有清除O2-.和·OH两种自由基的能力。微粒体是细胞内质网的碎片，含有混合功能氧化酶系统，包括细胞色素氧化酶P450(CYP450)，黄嘌呤氧化酶等多种酶系统。在氧化应激状态下，自由基作用于膜结构会攻击多不饱和脂肪酸，使其裂解生成MDA等终产物，发生脂质过氧化。MDA作为脂质过氧化损伤的产物之一，可反映脂质过氧化损伤程度。本研究采用的微粒体LPO模型[14]。通过MDA含量的变化评价三七醇提物的抗氧化活性。结果显示在不同微粒体模型中，相同浓度的三七醇提物表现出不同的清除MDA能力，这表明抗氧化剂的应用存在剂量的选择。因此抗氧化药物及其剂量的选择对抗氧化剂发挥抗氧化效果有重要的意义。实验结果显示，在CHP、Vc/Fe2+ 和CC14/NADP LPO模型中，三七醇提物在50~450 mg/(kg·d)浓度下，均能显著抑制MDA的生成，且有一定的剂量-效应关系，表明三七醇提物有较好的抗氧化作用。
γ射线照射能够引起受照射动物全身性自由基损伤，更甚者可致癌甚至死亡。肝脏是机体最主要的代谢器官，研究照射对肝脏氧化应激损伤的影响，能够有效判断损伤程度、检验药物抗氧化特性、测定剂量-效应关系，以及抑制氧化损伤的相关机制。在射线照射致氧化应激损伤模型中，阳性对照组肝组织中MDA含量明显高于阴性对照组，三七醇提物不同剂量干预后，与阳性对照组相比肝组织中MDA含量明显有改善，且呈剂量-效应关系。SOD是抗氧化防御体系中一类重要的金属酶类。照射后肝组织中SOD活性明显降低，给予三七醇提物干预后，活性进一步降低，随着给药剂量的加大，SOD活性有一定的改善，出现这种情况可能是由于照射后肝组织损伤过于严重，较低剂量的三七醇提物不能逆转损伤，随着剂量的增加表现出三七对氧化损伤的修复能力。CAT也是机体内抗氧化防御第一道防线的重要组成之一，照射后CAT活性应激性升高，三七醇提物干预后肝组织中CAT活性均有不同程度的升高，说明三七有提高CAT活性的作用。GSSG作为还原型GSH氧化应激的产物，能够间接的反映脂质过氧化的损伤情况。照射后大鼠肝组织中GSSG含量明显高于阴性对照组，不同浓度三七醇提物干预后肝组织中GSSG含量均有不同程度降低，显示三七可能直接抵御氧化损伤，降低还原型GSH的消耗从而减少GSSG的产生。
综上，三七醇提物在体内外模型中均表现出较好的抗氧化活性，并有剂量-效应关系。在不同的模型中，表现出不尽相同的抗氧化活性，在一定程度上也反映了自由基反应的多样性和自由基系统的复杂性。单一的抗氧化剂很难发挥最好的抗氧化作用，筛选、组合各种抗氧化剂，在抗氧化复合链[14]的共同作用下可用较小的剂量达到较好的抗氧化效果。
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收稿日期： ；修订日期：
作者简介： 胡军霞& (1985-& )，女，河南省洛阳市人，硕士研究生，研究方向：自由基生物学。Tel：029-，E-mail：hu8790348 zi @
*Correspondence to：HAI Chun-xu，Tel：029-，E-mail：cx-hai@ fmmu.
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