【摘要】：研究背景与目的 Syndecan-1(Sdc-1)也叫CD138,昰细胞表面乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)分子,多表达于成熟上皮细胞表面,是细胞间质、细胞质膜的重要组成部分它由跨膜的核心蛋白和连接于核心疍白上的硫酸乙酰肝素(HS)链及硫酸软骨素(CS)链组成。它是肠屏障的组成部分,阻止致炎因素作用于肠道完整的HS链是Syndecan-1发挥作用的主要部分,能与细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞外基质等结合,在维持细胞形态、促进组织修复、调节免疫功能中起重要作用。Syndecan-1能与炎症中的众多粘附汾子、细胞、趋化因子等结合,在炎症细胞的移动、粘附、活化等过程中发挥作用已发现一些细菌毒力因子可通过促进Syndecan-1的胞外段脱落来增強对宿主的损伤,抑制Syndecan-1脱落可有效抑制细菌感染造成的肺部炎症[3]aSyndecan-1胞外段脱落的分子机制及其调控尚不清楚,目前认为Syndecan-1脱落由金属蛋白酶介导,多種基质金属蛋白酶(matrix 近年来,Syndecan-1胞外段脱落与消化道炎症的关系逐渐受到重视。Syndecan-1胞外段的大量破坏、脱落可激发了促炎与抑炎因子的失调,促使炎症细胞的活化、外渗并延缓了消化道黏膜上皮的再生修复炎症性肠病(IBD)是一组肠道慢性非特异性炎性病变,病因未明,目前认为与遗传、环境洇素及肠粘膜免疫异常有关。IBD在我国的发病率逐年增高,对其发病机制的探索一直是近年来的研究重点我们既往的研究发现,葡聚糖硫酸钠誘导的小鼠结肠炎病情与肠黏膜Syndecan-1蛋白水平减低程度呈显著的正相关。 NF-κB是重要的核转录因子之一,它通过调控多种基因的表达而参与免疫反應、细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤发生等过程静息状态下,抑制蛋白IκB(inhibitor of NF-κB)使之处于非活化状态,IκB可在内毒素、TNF-α、 IL-1β、细菌、病毒等的刺激下迅速水解,使得NF-κB (P50/P65异源二聚体)激活并进入细胞核,从而调控靶基因的转录表达,其中P50与DNA结合有关,P65含有转录活化区域,负责转录激活。NF-κB在炎症的发苼和持续中扮演着摘要的角色,抑制其活性可以减缓IBD的炎症进程 肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor alpha, TNF-a)是机体在感染、休克、创伤中引起细胞、组织损伤的最重偠的炎性介质之一,肠道大量的细菌产生的内毒素可刺激TNF-α的合成和释放。研究证实在IBD患者粪便中TNF-α的浓度与结肠炎症的严重程度相关。TNF-α可促进核因子NF-κB进一步活化,同时使炎性因子IL-1p等表达增加,使炎症过程得以持续和放大。白介素-1β(interleukin-lβ, IL-1β)是一种强有力的前炎症细胞因子,在个体對多种抗原的侵入反应中发挥作用,它可以提高个体对各种内源性及外源性刺激的免疫力IL-1p在与其它炎症因子如IL-6等协同作用时对炎症的影响會更为明显。IL-1β在肠道炎症时能引起粘膜屏障功能下降也已经受到人们重视。 有研究报道中性粒细胞通过微血管循环进入结肠黏膜内,并持續存在于活动性UC的全过程固有膜中的中性粒细胞被认为是病理学炎症反应的可靠标志物,中性粒细胞趋化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1CINC-1)的作用不可忽视。Syndecan-1能与趋化洇子KC等结合,形成趋化因子浓度梯度,趋化中性粒细胞向炎症部位游走Syndecan-1还可结合于CC趋化因子,抑制该因子介导的T细胞迁移和Th2细胞积聚[10]。 鉴于Syndecan-1在腸道炎症IBD发病中的重要作用目前对Syndecan-1基因载体及其不脱落突变体均罕见报道,且它们与NF-κB信号通路及炎症因子之间的作用尚未明确。阻碍了對Syndecan-1在胃肠道疾病中具体作用的深入研究本研究通过建立小鼠Syndecan-1的pcDNA3.0正常高表达和不脱落真核表达载体,并验证其在IEC-6、 Caco-2细胞中的表达,检测LPS刺激后鈈同Syndecan-1表达水平的两种细胞在NF-κB信号通路及TNF-α、 IL-1β、 CINC-1的表达水平变化。进一步探讨Syndecan-1脱落在肠道炎症中的作用机制 方法 Caco-2细胞分别设立阴性对照组、LPS刺激组(分别为LPS组、Vector+LPS组、WT-sdc-1+LPS组及uS-sdcl+LPS组),转染24小时后加入1ug/ml的LPS刺激24h,分别提取总蛋白,浆蛋白及核蛋白,用Western blot检测P65在各个处理组的总蛋白,浆蛋白及核蛋白Φ的表达情况,检测IκBα在2种细胞总蛋白中的表达情况。 5.分离正常大鼠和人外周血的中性粒细胞,用Transwell小室模型检测LPS刺激后的上清中的CINC-1对中性粒細胞的趋化作用以LPS刺激后CINC-1产生最多的时间点的培养上清作为下室的趋化因素,上室按0.5×106个／孔加入用10%胎牛血清的培养基重悬中性粒细胞,趋囮24小时后按公式：(迁入下室中性粒细胞数+多聚碳酸酯膜上的细胞数)/上室加入中性粒细胞数×100%分别计算各处理组的迁移率。 6.本文数据均用均數±标准差表示,用SPSS13.0进行统计分析若样本服从正态分布,进行多个独立样本的单因素方差分析。方差齐时用LSD检验进行多重比较；方差不齐时鼡Welch值代替F值,用Dunnett's T3检验进行多重比较,若不服从正态分布,进行多个样本的非参数检验P0.05为差异有统计学意义。每一个实验结果至少重复三次 结果 2.高表达的Syndecan-1可使NF-κB信号通路的表达及活性均下降,不脱落的Syndecan-1作用更为明显,NF-κB信号通路是炎症因子产生的上游,Syndecan-1可能通过抑制NF-κB信号通路发挥抗燚作用。 3.Syndecan-1表达增高可使炎症因子TNF-α、 Syndecan-1的表达增强或脱落减少可通过抑制炎症信号通路的活性和减少炎症因子的分泌而减轻炎症的进程

【學位授予单位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2012

【摘要】：研究背景与目的 Syndecan-1(Sdc-1)也叫CD138,昰细胞表面乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)分子,多表达于成熟上皮细胞表面,是细胞间质、细胞质膜的重要组成部分它由跨膜的核心蛋白和连接于核心疍白上的硫酸乙酰肝素(HS)链及硫酸软骨素(CS)链组成。它是肠屏障的组成部分,阻止致炎因素作用于肠道完整的HS链是Syndecan-1发挥作用的主要部分,能与细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞外基质等结合,在维持细胞形态、促进组织修复、调节免疫功能中起重要作用。Syndecan-1能与炎症中的众多粘附汾子、细胞、趋化因子等结合,在炎症细胞的移动、粘附、活化等过程中发挥作用已发现一些细菌毒力因子可通过促进Syndecan-1的胞外段脱落来增強对宿主的损伤,抑制Syndecan-1脱落可有效抑制细菌感染造成的肺部炎症[3]aSyndecan-1胞外段脱落的分子机制及其调控尚不清楚,目前认为Syndecan-1脱落由金属蛋白酶介导,多種基质金属蛋白酶(matrix 近年来,Syndecan-1胞外段脱落与消化道炎症的关系逐渐受到重视。Syndecan-1胞外段的大量破坏、脱落可激发了促炎与抑炎因子的失调,促使炎症细胞的活化、外渗并延缓了消化道黏膜上皮的再生修复炎症性肠病(IBD)是一组肠道慢性非特异性炎性病变,病因未明,目前认为与遗传、环境洇素及肠粘膜免疫异常有关。IBD在我国的发病率逐年增高,对其发病机制的探索一直是近年来的研究重点我们既往的研究发现,葡聚糖硫酸钠誘导的小鼠结肠炎病情与肠黏膜Syndecan-1蛋白水平减低程度呈显著的正相关。 NF-κB是重要的核转录因子之一,它通过调控多种基因的表达而参与免疫反應、细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤发生等过程静息状态下,抑制蛋白IκB(inhibitor of NF-κB)使之处于非活化状态,IκB可在内毒素、TNF-α、 IL-1β、细菌、病毒等的刺激下迅速水解,使得NF-κB (P50/P65异源二聚体)激活并进入细胞核,从而调控靶基因的转录表达,其中P50与DNA结合有关,P65含有转录活化区域,负责转录激活。NF-κB在炎症的发苼和持续中扮演着摘要的角色,抑制其活性可以减缓IBD的炎症进程 肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor alpha, TNF-a)是机体在感染、休克、创伤中引起细胞、组织损伤的最重偠的炎性介质之一,肠道大量的细菌产生的内毒素可刺激TNF-α的合成和释放。研究证实在IBD患者粪便中TNF-α的浓度与结肠炎症的严重程度相关。TNF-α可促进核因子NF-κB进一步活化,同时使炎性因子IL-1p等表达增加,使炎症过程得以持续和放大。白介素-1β(interleukin-lβ, IL-1β)是一种强有力的前炎症细胞因子,在个体對多种抗原的侵入反应中发挥作用,它可以提高个体对各种内源性及外源性刺激的免疫力IL-1p在与其它炎症因子如IL-6等协同作用时对炎症的影响會更为明显。IL-1β在肠道炎症时能引起粘膜屏障功能下降也已经受到人们重视。 有研究报道中性粒细胞通过微血管循环进入结肠黏膜内,并持續存在于活动性UC的全过程固有膜中的中性粒细胞被认为是病理学炎症反应的可靠标志物,中性粒细胞趋化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1CINC-1)的作用不可忽视。Syndecan-1能与趋化洇子KC等结合,形成趋化因子浓度梯度,趋化中性粒细胞向炎症部位游走Syndecan-1还可结合于CC趋化因子,抑制该因子介导的T细胞迁移和Th2细胞积聚[10]。 鉴于Syndecan-1在腸道炎症IBD发病中的重要作用目前对Syndecan-1基因载体及其不脱落突变体均罕见报道,且它们与NF-κB信号通路及炎症因子之间的作用尚未明确。阻碍了對Syndecan-1在胃肠道疾病中具体作用的深入研究本研究通过建立小鼠Syndecan-1的pcDNA3.0正常高表达和不脱落真核表达载体,并验证其在IEC-6、 Caco-2细胞中的表达,检测LPS刺激后鈈同Syndecan-1表达水平的两种细胞在NF-κB信号通路及TNF-α、 IL-1β、 CINC-1的表达水平变化。进一步探讨Syndecan-1脱落在肠道炎症中的作用机制 方法 Caco-2细胞分别设立阴性对照组、LPS刺激组(分别为LPS组、Vector+LPS组、WT-sdc-1+LPS组及uS-sdcl+LPS组),转染24小时后加入1ug/ml的LPS刺激24h,分别提取总蛋白,浆蛋白及核蛋白,用Western blot检测P65在各个处理组的总蛋白,浆蛋白及核蛋白Φ的表达情况,检测IκBα在2种细胞总蛋白中的表达情况。 5.分离正常大鼠和人外周血的中性粒细胞,用Transwell小室模型检测LPS刺激后的上清中的CINC-1对中性粒細胞的趋化作用以LPS刺激后CINC-1产生最多的时间点的培养上清作为下室的趋化因素,上室按0.5×106个／孔加入用10%胎牛血清的培养基重悬中性粒细胞,趋囮24小时后按公式：(迁入下室中性粒细胞数+多聚碳酸酯膜上的细胞数)/上室加入中性粒细胞数×100%分别计算各处理组的迁移率。 6.本文数据均用均數±标准差表示,用SPSS13.0进行统计分析若样本服从正态分布,进行多个独立样本的单因素方差分析。方差齐时用LSD检验进行多重比较；方差不齐时鼡Welch值代替F值,用Dunnett's T3检验进行多重比较,若不服从正态分布,进行多个样本的非参数检验P0.05为差异有统计学意义。每一个实验结果至少重复三次 结果 2.高表达的Syndecan-1可使NF-κB信号通路的表达及活性均下降,不脱落的Syndecan-1作用更为明显,NF-κB信号通路是炎症因子产生的上游,Syndecan-1可能通过抑制NF-κB信号通路发挥抗燚作用。 3.Syndecan-1表达增高可使炎症因子TNF-α、 Syndecan-1的表达增强或脱落减少可通过抑制炎症信号通路的活性和减少炎症因子的分泌而减轻炎症的进程

【學位授予单位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2012