计算细胞周期的长短不同,主要取决于需要知道什么？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2024-02-14 04:30 标签： 细胞周期的长短不同,主要取决于
细胞周期分为G1期、S期、G2期和M期，不同时期细胞内DNA含量有很大差异；G1/G0期具有2倍体细胞的含量（2N）；到G2/M期，细胞已完成DNA复制，而细胞质未完成分离，变为4倍体细胞（4N）；S期是DNA复制期，DNA含量介于2N和4N之间。溴化丙啶（PI）是一种核酸染料，可结合DNA和RNA，通过RNA酶处理，去除RNA，再利用流式细胞分选仪检测细胞内的DNA含量，可以确定细胞所处的细胞周期时相，以及各相细胞所占的比例。方法和步骤①取一盘处于对数期生长的HeLa细胞，弃培养基，PBS洗—遍，吸弃PBS。②加1ml消化液消化细胞，将细胞转移至离心管中，300g离心5分钟，弃上清。③用0.25ml预冷的PBS悬浮细胞，缓慢加入0.75ml预冷的95%乙醇，混匀。④4℃或-20℃固定30分钟以上。⑤300g离心5分钟，弃上清。⑥加入100μl PBS重悬细胞，加入1μl RNA酶A，室温孵育15分钟。⑦300g离心5分钟，弃上清。⑧加入100μl PBS，悬浮细胞，加1ml PI，室温，避光孵育15~30分钟。⑨加入500μl PBS，悬浮细胞，用300目细胞筛过滤，将细胞转移到FACs管中。⑩在流式细胞仪上488nm激发波长检测，计算10 000个细胞。注意事项①95%乙醇应逐滴加入，边加边混匀，以免细胞聚集成团。②加入PI后，应注意避光，以免荧光淬灭。常见问题1、所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？答：RNase用PBS配制，注意要用沸水浴去除DNase的活性。2、测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？答：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率可以同时测定。3、还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？答：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。4.
细胞在乙醇固定之后还看到有细胞沉淀，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机就发现不了细胞了。这是怎么回事呢？怎么解决这个问题？答：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：①尽量采用尖底的离心管和水平离心机。②离心的转速或时间可稍微增加一点儿。③离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。④每次加液体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

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