本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法。

近年来，非损伤性取样在保护生物学以及分子生态学中的应用得到了广泛的关注和重视，而粪便由于：(1)可以非损伤性地获取研究对象的肠上皮细胞，具有无创、无痛、无侵害性的优点；(2)动物排便具有常规性和节律性，因此粪便样品的数量充足，相比较于其他样本类型而言可提供足量的样本来源；(3)粪便样本可以在不触及甚至在看不到动物实体的情况下进行采集，尤其在针对凶猛大型食肉动物的情况下，可最大程度地保证采样人员的安全，同时也将采集过程中对动物的干扰降至最低；(4)粪便采集容易操作，成本较低。因此粪便是野外动物研究和动物园等人工饲养动物管理中最为常用的样品。通过从粪便中存在的宿主肠道上皮细胞中提取出的宿主dna，在物种鉴定、交配系统分析、遗传多样性评价、种群遗传结构分析、系统地理学研究等方面都发挥着重要作用。

研究表明，每克新鲜粪便中含有10⁵个肠上皮细胞，其中大多数仍然保持完整，继续维持正常的生命活动，然而粪便干重的55％以上由细菌构成，这些细菌来源于肠道菌群和周边环境。因此从粪便中提取的总dna中，宿主dna的含量极少，且常常含有抑制分子生物学反应的物质，导致后续实验的分析成功率很低，尤其对于核基因组的分析更是困难，如微卫星和snp分型结果的确认不得不反复重复多次，不仅大大增加了实验成本，而且还严重了影响数据的可靠性。

因此，如何提高粪便中宿主dna的提取效率，降低细菌dna所占的比例是目前粪便dna提取技术中的关键。现今针对粪便中宿主dna富集的方法主要有dna甲基化免疫共沉淀技术、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、介电泳分离法(dep)、商业化粪便dna提取试剂盒等，上述方法中存在如下特点和缺陷：

(1)宿主dna的富集效率仍然不够理想，尤其对于核基因组的富集更加困难。

就dna甲基化免疫共沉淀技术而言，该种方法可以富集到高纯度的宿主核基因组的甲基化片段，但是由于宿主线粒体基因组发生甲基化的概率很小，所以该种方法无法实现对线粒体遗传物质的富集；就免疫磁珠法，介电泳芯片法而言，该类方法对宿主dna的富集可以达到很高的纯度，但由于细菌dna的数量过于庞大，干扰严重，对宿主细胞的捕获概率很低，最终造成获得的宿主dna的富集量较少；目前应用最为广泛的是qiagen公司推出的qiaamp试剂盒，总体上对宿主线粒体基因组的富集效果尚可满足大多数实验需要，但对宿主核dna的富集效果仍旧不够理想，在进行微卫星位点检测时，同一个样本至少要重复5～7次，按照以“少数服从多数”的方式获得最终分型结果，准确度很低。

(2)对于陈旧粪便而言宿主dna提取效率更差。

现今应用的各种粪便中宿主dna的富集技术，基本上都更适合于新鲜粪便，尤其对于scsr-ttm试剂盒、甲基化共沉淀法、磁珠分选法、介电泳芯片法以及密度梯度离心法等，对于粪便样本的新鲜程度要求更为严格。目前，虽然qiaamp试剂盒对样本的新鲜程度要求相对宽泛，但对陈旧粪便中宿主dna的富集效果并不理想。

(3)成本高，消耗大。

现有的粪便样本中宿主dna的富集技术都较为昂贵，对于甲基化免疫共沉淀法、磁珠分选法和介电泳芯片法等，一个样本就需要200～500元人民币，因此绝大多数仅在非常必要时才被使用。对于qiaamp粪便dna提取试剂盒而言，每个样本也仍需要50元左右，对于大量样本分析在成本上也是难以接受的。

甲基化共沉淀法、磁珠分选法、介电泳芯片法以及密度梯度离心法等，其操作过程繁琐复杂，条件要求严格，耗时较长。

针对目前从粪便样本中提取宿主dna时，对粪便质量要求严格、宿主dna富集效率低、成本高等问题，本发明提供了一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法，在提取粪便dna前，将粪便样本先经sds进行预处理，所述预处理方法如下：

1)将粪便样本与10mmol/l磷酸缓冲液pbs溶液混合后，加入sds溶液至终浓度为0.01％～5％(质量)混匀，在室温下静置1～30min；

2)然后离心取上清，上清液用于dna的提取。

进一步地限定，当步骤1)中针对草食兽粪便样本时，经所述预处理后室温下静置时间1～15min。

进一步地限定，当步骤1)中针对肉食兽粪便样本时，经所述预处理后室温下静置时间为1～10min。

进一步地限定，步骤1)中所述粪便样本与磷酸缓冲液pbs溶液的比例为180～220mg：300μl。

进一步地限定，步骤1)中所述加入sds溶液终浓度为1％(质量)。

进一步地限定，步骤2)中所述提取dna的方法包括基因组dna试剂盒提取法和有机溶剂抽提法。

更进一步地限定，步骤1)中所述草食兽粪便样本经所述预处理后室温下静置时间5min。

更进一步地限定，步骤1)中所述肉食兽粪便样本经所述预处理后室温下静置时间为3min。

(1)本发明无论对于粪便中宿主的线粒体dna还是核dna，都具有良好的富集能力。与目前广泛应用的qiaamp试剂盒相比，对宿主线粒体dna的富集效率提高10¹～10³倍，对宿主核dna的富集效率可提高10¹～10⁴倍。

(2)本发明对粪便样本的质量要求相对宽泛，不仅适用于新鲜粪便，对常规冷冻保存的陈旧粪便也同样具备良好的富集能力，与qiaamp试剂盒相比，宿主线粒体dna的富集效率可提高1～10³倍，宿主核dna的富集效率提高10¹～10⁴倍。

(3)本发明适用范围广，无论针对草食还是肉食哺乳动物粪便中宿主dna，都同样具有良好的富集效果。

(4)本发明涉及到的所有操作都属于实验室常规操作，实验步骤简单易行，整个过程仅需30min～40min即可完成。

(5)由于sds价格低廉，该种方法对于每个粪便样本的处理成本仅为几角钱，大大降低了实验的成本消耗；在实际操作中仅需要水浴锅，移液器，离心机等常用设备，一般普通实验室即可满足，因此通用性极强。由于成本低、要求低，本方法可适用于大规模、多批次的粪便样本提取，大大扩展了粪便样本在动物研究中的应用。

图1：不同粪便样本(包含不同物种和不同的采集年份)在qiaamp试剂盒和最佳sds裂解条件下对宿主dna(包含核dna和线粒体dna)的富集效果(以宿主dna拷贝数/细菌dna拷贝数表示)比较；横坐标代表不同的粪便样本，纵坐标代表对宿主dna的富集效率；其中：

代表粪便样本用本发明方法对宿主线粒体dna的富集效率；

代表粪便样本用qiaamp试剂盒对宿主线粒体dna的富集效率；

代表粪便样本用本发明方法对宿主核dna的富集效率；

代表粪便样本用qiaamp试剂盒对宿主核dna的富集效率。

图2：部分粪便样本用本发明方法所获得宿主dna与同一个体的血液dna对str位点扩增分型的结果比较，横坐标为片段长度，单位bp；纵坐标为检测信号的强度。其中a:东北虎2号个体血液样本微卫星位点fca146的分型图谱，b:该个体同一位点在粪便样本的分型图谱；c:马鹿6号个体血液样本微卫星位点32分型图谱，d:该个体同一位点在粪便样本的分型图谱；e:狗4号个体血液样本微卫星位点cph758分型图谱，f:该个体同一位点在粪便样本的分型图谱；g:蓝狐1号个体血液样本微卫星位点cph9分型图谱，h:该个体同一位点在粪便样本的分型图谱。

该种方法根据粪便中肠道上皮细胞与细菌外壁结构和抗破坏能力的不同，选取价格低廉的十二烷基硫酸钠(sds)作为裂解剂，通过控制sds的浓度以及对粪便的作用时间，得到最佳的裂解条件。在该种条件下，可以最大程度上裂解宿主细胞，使宿主dna释放到溶液中，同时尽可能地保持细菌结构的完整性，实现dna的差异化提取。提取时，只需要高速离心，抽取上清液，用常规的dna提取技术(有机溶剂抽提法以及各类商业化的普通基因组dna提取试剂盒等)即可从上清液中富集得到在纯度和数量上都较为可观的宿主dna，减少细菌dna的残留量。

本发明的关键创新点在于粪便样本在提取前进行的sds预处理，通过控制sds的浓度和作用时间，针对肉食兽和草食兽的粪便分别得到了最佳的sds裂解条件，在该种条件下，可以实现宿主肠上皮细胞充分裂解，同时又能最大程度地保持细菌细胞的完整性。

下面具体描述本发明所述的从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法。

实施例1.从梅花鹿粪便中高效富集宿主dna的方法。

1.采用无菌手术刀和剪刀对粪便样本进行切割，称取180mg的粪便放于灭菌后的2ml离心管中，严格保证这一过程中工具(剪刀、镊子和手术刀)的清洁，以免外源dna污染和样本间的交叉污染。向离心管中加入300μl10mmol/l的pbs溶液，随后加入sds至终浓度1％，使样本与溶液快速混合均匀，瞬时离心后在室温下静置5min。

2.然后12000×g离心10min，吸取出上清液备用，弃去沉淀。

上述处理获得的上清液可通过任何常规dna提取技术提取dna，如普通基因组dna商业试剂盒法、化学抽提法等等。本实施例以axyprep基因组dna小量试剂盒(axygen)为例描述最终的dna提取方法，接续如下：

3.向离心后得到的上清液中加入150ulbufferc-l、20ulpk酶，混合均匀后瞬时离心，置于56℃水浴锅内温育10min。

5.在2mlpe管中放入dna制备管，将离心后的上清液吸取到制备管中，12000×g离心1min。

9.弃滤液，将dna制备管置回到原来的2ml离心管，12000×g离心1min。

实施例2.重复实施例1，本实施例以东北虎粪便为例，描述富集dna的方法。

1.采用无菌手术刀和剪刀对粪便样本切割，称取220mg的粪便于灭菌后的2ml离心管中，此过程中严格保证工具(剪刀、镊子和手术刀)的清洁度，以免外源dna的污染和样本间的交叉污染。向离心管中加入300μl10mmol/l的pbs溶液，随后加入sds至终浓度1％，快速混合均匀，瞬时离心，在室温下静置3min。

2.然后12000×g离心10min，丢弃离心管中的沉淀，吸取出上清液备用。

后续dna提取方法同实施例1所述。

实施例3.重复实施例1，与实施例1(梅花鹿)的不同在于，本实施例中步骤1中的静置时间为15min。

实施例4.重复实施例1，与实施例1(梅花鹿)的不同在于，本实施例中步骤1中加入sds至终浓度0.01％，静置时间为1min。

实施例5.重复实施例1，与实施例1(梅花鹿)的不同在于，本实施例中步骤1中加入sds至终浓度5％，静置时间为30min。

实施例6.重复实施例2，与实施例2(东北虎)的不同在于，本实施例中步骤1中的静置时间为10min。

实施例7.重复实施例2，与实施例2(东北虎)的不同在于，本实施例中步骤1中加入sds至终浓度0.01％，静置时间为1min。

实施例8.重复实施例2，与实施例2(东北虎)的不同在于，本实施例中步骤1中加入sds至终浓度5％，静置时间为30min。

一、同时用qiaamp试剂盒对相同的粪便样本进行提取，比较qiaamp试剂盒和本方法在上述实施例中对宿主dna(包含线粒体dna和核dna)的富集效率(见表1，表2)，其中宿主线粒体dna的富集效率用线粒体dna与细菌dna拷贝数的比值来衡量，宿主核dna的富集效率用核dna与细菌dna拷贝数的比值来衡量。结果显示，无论对草食兽还是肉食兽的粪便，当sds的终浓度在0.01％～5％，作用时间在1min～30min之间时，都具有较强的宿主dna富集能力。对草食兽粪便最经济的条件为：sds终浓度为1％，作用时间为5min；对肉食兽粪便最经济的条件为：sds终浓度为1％，作用时间为3min。

表1-本方法与qiaamp试剂盒对草食兽粪便(以梅花鹿为代表)宿主dna富集效率(宿主dna拷贝数：细菌dna拷贝数)的比较

表2-本方法与qiaamp试剂盒对肉食兽粪便(以东北虎为代表)宿主dna富集效率(宿主dna拷贝数：细菌dna拷贝数)的比较

二、考察本发明方法的有效性和通用性。

参照上述实施例1和实施例2中所述的最佳处理条件，分别对以下物种、不同保存时间的粪便样本进行宿主dna的富集，同时与qiaamp试剂盒的提取结果进行对比，从而验证本发明方法的有效性和通用性。

以上粪便样品采集后在-20℃条件下保存至2019年。通过对两种方法提取的总dna进行细菌dna、宿主线粒体dna、宿主核dna拷贝数的绝对定量结果的分析和比较，如图1所示，对于各个粪便样本，本发明方法获得的宿主dna的富集效率均要高于qiaamp试剂盒。以细菌dna拷贝数作为标准，本方法富集得到的宿主线粒体dna和核dna的拷贝数分别是细菌拷贝数的10^-3～10⁰倍和10^-4～10^-1倍，而qiaamp试剂盒为10^-5～10^-1倍和10^-7～10^-4倍，也就是说，对于线粒体dna的富集效率，本方法是qiaamp试剂盒的10¹-10³倍，对核dna的富集效率，本方法是qiaamp试剂盒的10¹-10⁴倍。对于储存时间5年以上的陈旧粪便，无论是肉食兽还是草食兽，相较于较新鲜粪便，本方法对核dna的富集效率比qiaamp试剂盒高10²-10⁴倍。

以上结果说明，本发明的方法对于哺乳动物中各个物种粪便样本提取的通用性，对粪便样本的质量要求宽泛，对陈旧粪便的富集效果更有优势。

选取6只东北虎、5只狗、8只蓝狐、7只马鹿的血液样本和其对应的粪便样本，用本方法提取的粪便dna与同一个体的血液dna同时进行了26个str位点的核扩增毛细管电泳分型。部分结果如图2所示。本方法得到的粪便dna，微卫星一次扩增分型的成功率均在85％以上，其中22个位点的成功率达到100％。而在文献中用其他方法提取的粪便dna对于str的一次分型成功率大都在40％以下。

分别参照实施例1和实施例2的制备方法，选取7头牛、5只狗的粪便dna样本，每个样本进行10个snp位点的检测，以同一个体的血液dna分型结果进行比较，本方法提取的粪便dna，90％以上的snp位点分型成功率为100％，其余位点的分型成功率也都在90％以上。因为宿主dna质量所限，文献中很少有snp分型的报到，少数报道的成功率也很低。

选取1个东北虎和1个马鹿个体的粪便样本和对应同一个体的血液样本，粪便样本采用本发明的方法提取dna，血液样本采用常规方法提取dna。以所获dna进行基因组重测序，血液dna的测序深度为10×，粪便样本dna的测序深度为30×。比较显示，两个物种粪便dna获得的基因组重测序数据，如cleanbase(bp)、effectiverate(％)、errorrate(％)、q20(％)、q30(％)、gccontent(％)以及nt比对结果与血液样本dna的结果基本无异。

通过str、snp和基因组重测序，验证了本发明方法从粪便中获得的宿主dna在常规分子标记的分型效果接近于血液，对宿主基因组的重测序质量达到血液dna的水平。