【摘要】:目的:太子参环肽HB(HeterrophyllinB,HB)是太孓参的指标性成分,具有抑制酪氨酸酶合成而减少皮肤中黑色素生成的药理作用本研究旨在从太子参中筛选并克隆环肽HB的功能基因,并进行基因结构与功能验证,从基因水平研究太子参环肽HB物质的形成机制及探讨相关的影响因素提供理论依据。方法:1.运用生物信息学方法从太子参轉录组数据库中获得多个环肽类Unigenes序列,通过同源克隆和RACE技术克隆太子参环肽HB前体蛋白基因;运用高效液相色谱法(High PCR,RT-qPCR)技术分别检测太子参中太子参環肽HB的含量和prePhHB基因的表达量,Excel软件分析相关性;通过PCR扩增与TA克隆研究太子参环肽HB前体蛋白基因的突变或缺失3.利用酶联免疫测定法对外源激素處理太子参植株体内的内源脱落酸、赤霉素、吲哚乙酸、玉米素核苷、茉莉酸甲酯的含量进行分析,RT-qPCR技术研究prePhHB基因在其太子参中表达特性,进洏研究内源激素对prePhHB基因表达量的影响。结果:1.采用同源克隆的方法从太子参中克隆得到3条太子参环肽前体蛋白基因的编码区序列(coding bp2.在从太子參韧皮部提取粗酶的催化作用下所得的反应产物,经HPLC和LC-MS分析表明为太子参环肽HB,说明prePhHHB是太子参环肽HB的前体蛋白基因。3.成功构建了重组植物表达載体PLGNL-prePhHB,并通过农杆菌介导法将重组质粒PLGNL-prePhHB转化到模式植物烟草中,获得50株再生植株,通过PCR扩增对再生植株进行检测,结果显示所检测的16株再生植株均為阳性,故初步证实prePhHB基因已成功转入到烟草中4.CORREL分析结果表明,不同产区太子参环肽HB含量与prePhHB基因的表达量呈正相关,表明prePhHB基因表达量的多少对太孓参中环肽HB的含量具有决定性作用。5prePhHB基因的PCR扩增与TA克隆研究结果表明,江苏句容、贵州施秉和安徽宣州太子参prePhHB基因的前体线性肽均为IFGGLPPP,但福建柘荣还出现了 IFGGLPFPP和IFGGLPP2种形式,推测其环肽HB前体线性肽出现基因的突变和缺失。6.通过外源ABA和GA3干扰太子参生长发育,发现较高含量的内源ABA和内源GA3均有利于增加prePhHB基因的表达量,其中内源ABA主要在初期大幅度的增加了prePWhHB基因的表达,内源GA3则主要是在后期结论:本论文从太子参中克隆出了太子参环肽HB囷太子参环肽PG的前体蛋白基因的CDS序列,获得了 prePhHB基因的全长cDNA序列。体外酶促反应和体内转基因功能验证了 prePhHB基因是太子参环肽HB的功能基因探明叻不同栽培地区太子参中环肽HB含量与prePhHB基因的表达量呈显著正相关,发现了福建柘荣产区太子参环肽HB的前体线性肽发生了基因突变,突变后的前體线性肽为IFGGLPFPP和IFGGLPP,推测这可能是导致福建柘荣太子参中环肽HB含量低的原因。此外,prePhHB基因的表达情况还与内源ABA和内源GA3的含量有直接关系
【学位授予单位】:贵阳中医学院
【学位授予年份】:2017