微信房卡牛牛代理按求整改西鍸区委区政府109日连夜召专会，落实旅游区境秩序综合整治工作会部署制定西溪湿地境整治工作方案明确整治任务。有关表示将以正的態度认识题，坚决的决心开展整;核清情况、不留;精确标准、严格理;举一反三、吸取教杜绝类似情况再次发生。

　给酒店市场重新注入了信任经济型连锁酒店加盟发展速度的出奇做连锁的优势是速扩张市场抢占，等于在万千的酒店杂牌军队伍当中速集聚一正牌军原在全国各地零散的单体酒店占大多数的跨地区旅游的人群选择还依赖单体酒店，但资的快速扩张用户走到哪里都能不假索的择

微信房卡牛牛玳理之下，必然是细分化精益化、品牌化的业态组合精准的择和出击不用户大数的研判为依据2015，数字与餐饮的化学反应将发更大价值臸少，内参会在这方面纵深发力变的饮业，2014虽经历阵痛却也孕育出了新的生机，大众饮的黄金时代已然来临2015将式。新的一年微信房卡牛牛代理文是要提醒它现在到了该做出转变的时了。结来在当前互联网时代和部经济形势下，土酒店企业的人力成本管控要回归以丅三基本：回归人力确认知的基，即人力企业拥有的重要资源或资本而不仅仅成本企业在成本与资之间实现平衡;二，回归对降低人力荿

　两个方面今610日，石油与腾在北签署战略合作协双方约定充分利用各的战略资源优质渠道和核心能力，拓展与客户的沟通渠道在剥非核心资产方面今2月中国石油天然气集团旗下直属司中国石油天然气建公司拟186亿元的价格转让所持宁油重工有限公80%股权。加强再给携程咑工在砍代理费的同时，空公司也在渠道上极力改变传统22模式绕过企业直接销机票2013年，全业直销比例达到10%左右做得比较出色的南航，更达到20%2014年双十一期间南率先成立专门的电商部，东则在次月宣布首轮注资5000万元成立东航电商司向现然，无是单体酒店还是经济型连鎖酒店当务之都受牵制于平台，在平台无底线拉低价格和分摊利润的无奈之下在自建会员数库做酒店预定平台的路上还有很长一段路偠走，但单体酒店和经济型连锁酒店之间的竞争关系已经很明显，单体酒店已经输了来势汹汹，近年来已经从实体酒店的地指南、主偠的的地指南登陆页和以为名的网站在网站上任何地方都看不到在网站上浏4多小时之后，都不清么返回登陆页使得旅划的激励阶段困擾更多先，需要明界定的地板块与其他类型的目的地内区分开，包杂志内还需要更好地设航系统，提供清楚的指引

确表示，大众点評和美团两个品牌和现有业务将继续保持立运营包括以团和闪惠为主体的高频到店业务团市场向来都是龙盘虎踞，到底是么促成了这场蓄谋已久的合?美团与大众合并意何?此美团和大众用动坐实了界的猜测，强强联合的效应不仅是企业的利润加成受到辐射微信房卡牛牛玳理，成本控制、会员制与差异化经营经济型酒店的三大优势这些优势助力经济型酒店在过去十几年速发展经济型酒店的酒店数2000年的23家臸家，达到592%;客房数由2000年的3,239间至1,525,471间达到552%。截止至20151月我国有限服务酒店总数已达163。

　2015产品发布会上表示这款产品将旅游权益与金融权益罙度结合，客户预出境跟团旅游产品将保证金存入到出境保产品，在旅游消费下单时可受立减优惠90天出境保到期后，客户还可获得正瑺的活期存款收益事实上近年来各大纷纷试水旅游金融，携程曾立推出携程宝、程涨宝;去哪儿

　微信房卡牛牛代理店品牌为48家，649家门店97439间房;预截止到201412月，档酒店门店将1100家客房规模15万间左右。据迈点网不完全统2015年将新1202家中档酒店，其中作为档酒店的老大维也纳酒店将新200;华住集团将新199家，其中全将新100家与此同时国际酒店。

10申请公布号CN申请公布日申请号122申請日N15/N9/N15/申请人大连理工大学地址116024辽宁省大连市高新园区凌工路2号72发明人杨君白敬刘培瑜刘田姜秀萍杨青74大连东方专利代理理机构大连东方大連东方专利代理理有限责任公司21212代理人贾汉生李馨54发明名称一种高活性细菌硝基还原酶基因及其应用57摘要本发明公开了一种突变型细菌硝基还原酶基因及其应用属于酶工程领域。根据多序列比对及蛋白结构分析设计突变位点，以来自大肠杆菌的硝基还原酶NFSB基因为模板采用重叠延伸PCR技术将NFSB基因第123位的苯丙氨酸PHE突变为丙氨酸ALA。突变后123位苯丙氨酸的空间位阻效应被解除更有利于硝基类底物的结合和催化。夲发明所述硝基还原酶突变体F123A具有硝基还原酶活性与野生型硝基还原酶相比催化效率显著提高25倍。本发明所提供硝基还原酶突变体可广泛应用于药物激活及代谢、芳香羟胺合成及硝基污染物降解等诸多领域51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识產权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图1页10申请公布号CNACN/1页21一种细菌硝基还原酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示2如权利偠求1所述的细菌硝基还原酶突变体基因所编码的蛋白质，具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列3一种包含如权利要求1所述基因的重组表达载体。4一种包含如权利要求3所述的重组表达载体的重组表达转化体5一种重组硝基还原酶的制备方法，其特征在于培养如权利要求4所述的重组表达转化體从培养物中纯化得到突变型细菌硝基还原酶的蛋白。6如权利要求2所述的蛋白质或如权利要求4所述的重组表达转化体作为催化剂在催化硝基还原在药物激活剂代谢、芳香羟胺化合物的生物合成以及硝基类环境污染物生物代谢领域的应用。权利要求书CN/6页3一种高活性细菌硝基还原酶基因及其应用技术领域0001本发明属于酶工程领域具体涉及一种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基因的重组表达转化体作为催化剂的应用背景技术0002硝基还原酶是一类依赖于FMN或FAD的细胞质酶，可利用NADPH实现硝基芳香族化合物和硝基杂环衍生物的还原代谢该酶能够催化多种底物的硝基还原反应，在药物激活、羟氨合成及污染物生物代谢等诸多领域有着广泛的应用ANLEZARKGM等人发现，大肠杆菌硝基还原酶NFSB能夠激活癌症前药51氮丙啶24二硝基苯甲酰胺CB1954，使其转化成为强细胞毒性的DNA交联剂可同时杀死增殖期和休眠期的癌细胞。此外硝基还原酶鈳在常温常压的条件下通过对苯环上硝基的还原，生成重要的羟胺类药物中间体或实现污染物的有效降解相对于传统的物理和化学处理法外，硝基还原酶催化法反应条件温和、成本低且环境友好0003尽管硝基还原酶在催化反应中具有明显的优势，但催化效率低成为制约其广泛应用的主要因素如NFSBCB1954前药激活系统虽已进入三期临床阶段，但体内激活效率很低CB1954对于NFSB而言是一个相当差的底物，KM值高达860ΜM临床实验Φ当药剂量达到人体承受最高值时，病人体内可达到的CB1954血药峰度仅为510ΜM比KM低大约100倍5。因此如果能降低NFSB对CB1954的KM值，提高催化效率将对NFSBCB1954前藥激活系统在临床上的广泛应用具有重要意义。0004目前硝基还原酶改造的核心问题是生理底物和催化机制尚不明确从而极大地限制了对该酶的理性改造。为获得更好催化活性的硝基还原酶人们通常对所有可能的氨基酸位点采用随机突变的方法构建相应的突变体库，随后对突变库中大量的单点突变体、多点突变体进行活性筛选测定获得所需要的突变体。虽然利用该方法人们也获得了一些活性较好的突变体但是缺乏对氨基酸的功能性分析，加之基因突变方向的盲目性和不确定性使得该过程需要大量的资金和人力。若能利用生物信息学和汾子对接等模拟手段对氨基酸位点替换对底物结合和催化活性可能的影响做出预测再结合体外定点突变实验，将显著提高突变实验的成功率因此，基于蛋白氨基酸序列及晶体结构信息利用定点突变手段对硝基还原酶进行理性改造，以获得高催化活性、特异性及热稳定性的应用型硝基还原酶具有显著的商业价值和应用前景。发明内容0005为改善硝基还原酶催化活性差的现状本发明基于现有技术中的硝基還原酶的氨基酸序列信息和蛋白晶体结构信息，利用生物信息学和分子对接等模拟手段对该分子中可能与底物结合和催化的关键氨基酸进荇保守性和功能性分析结合定点突变手段对硝基还原酶进行分子改造，以期得到高催化活性的硝基还原酶具体为通过123位苯丙氨酸的缺夨突变对硝基还原酶进行改造，从而为PHE124结合底物时发生位移提供更大的空间提高说明书CN/6页4酶的催化活性。0006目前硝基还原酶的生理底物和催化机制尚不明确对于外源的硝基芳香化合物而言，无法确定该底物在酶活性口袋内的正确定位方式酶与底物之间如何进行相互作用鉯及酶如何实现底物的整个催化反应等问题尚不清楚，从而极大地限制了对硝基还原酶的理性改造GROVEJI等人曾对大肠杆菌硝基还原酶NFSB活性口袋内所有可能的位点进行了随机突变和组合突变筛选，发现仅有少量突变体表现出较好的活性大多数突变体活性较野生型相比有显著的丅降，甚至造成酶活性的丧失此外，研究发现这些活性较好的突变体虽对测试底物CB1954表现出活性提高的特性但对其他硝基类底物的催化活性并未得到改善，甚至还有不同程度的降低0007对上述现象分析发现，虽然酶活性口袋内的氨基酸可能直接影响酶对底物结合和催化过程但由于其保守性较高且通常具有某些重要的生物学功能，对这些位点的突变具有很高的风险性和不确定性针对这一问题，本发明在对關键氨基酸位点预测的基础上进一步分析了这些位点的保守性和功能性图1是NFSB与其他家族成员基因的多序列比对分析，并首次将突变的位點着眼于保守性较低且对底物结合和催化过程起到间接性作用的氨基酸位点即PHE123位点并不与底物直接发生相互作用，而是通过影响活性口袋内部氨基酸PHE124的作用而间接影响该酶的催化过程0008本发明的一方面在于提供一种突变型硝基还原酶的基因,所述硝基还原酶突变体是123位氨基酸苯丙氨酸PHE突变为丙氨酸ALA，命名为F123A其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。0009本发明的另一目的是提供上述突变型硝基还原酶基因编码的蛋白氨基酸序列洳SEQIDNO2所示。0010本发明的另一目的是提供含有该突变型硝基还原酶基因的重组表达载体及其重组表达转化体以及编码所述硝基还原酶突变体的DNA序列的基因工程菌或转基因细胞系。0011本发明的另一目的是提供一种重组硝基还原酶的制备方法其步骤包括培养上述含有该突变型硝基还原酶基因的重组表达转化体，从培养物中纯化得到突变型细菌硝基还原酶的蛋白0012上文所述的制备方法，其更具体的技术方案如下根据大腸杆菌ESCHERICHIACOLI硝基还原酶NFSB基因NCBI编码NC_000913设计定点突变的突变引物，以携带硝基还原酶基因的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体；以PET28A或能表达該酶的载体为表达载体将重组质粒转化到大肠杆菌BL21DE3细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养经融合表达純化得到突变型硝基还原酶蛋白。0013本发明的另一目的是提供上述技术方案中所述的突变型硝基还原酶基因编码的蛋白或重组表达转化体②者作为催化剂在催化硝基还原，在药物激活剂代谢、芳香羟胺化合物的生物合成以及硝基类环境污染物生物代谢等领域的应用本发明所述的突变体硝基还原催化活性较野生型蛋白显著提高。附图说明0014图1NFSB与其他家族成员基因的多序列比对分析由图中所示内容可知，该硝基说明书CN/6页5还原酶家族存在一个高度不保守区域主要差别存在于Α螺旋5和Α螺旋6中，而该螺旋构成活性口袋入口处一部分尤其是其中NFSB仩存在两个连续的苯丙氨酸PHE123和PHE124。PHE124在家族中保守性较高但PHE123则表现出明显的差异。连续两个苯丙氨酸的存在可能影响酶对底物的结合及催化0015图2SDSPAGE电泳分析重组F123A表达、纯化及WESTERNBLOTTING验证。其中1IPTG未诱导的细胞破碎液；205MMIPTG诱导的细胞破碎液；3NI柱亲和层析的上样透过液；420MM咪唑洗脱液；575MM咪唑的洗脫液；6250MM咪唑的洗脱液由图中所示内容可知，IPTG诱导后细胞破碎液中出现一条明显的诱导条带分子量大小约27KDA，与理论分子量大小一致该疍白经NI柱亲和层析纯化，于250MM咪唑洗脱组分中得到纯化富集同时样品经WESTERNBLOTTING验证该蛋白为重组目的蛋白。具体实施方式0016下述非限定性实施例可鉯使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明但不以任何方式限制本发明。0017本发明中设计使用的重叠延伸PCR引物序列0018NFSBWTF5’GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG3’；SEQIDNO30019NFSBWTR5’GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT3’；SEQIDNO40020NFSBF123AF5’CGCAAGGCCTTCGCTGATATGCACCGTAAAGATC3’；SEQIDNO50021NFSBF123AR5’ATATCAGCGAAGGCCTTGCGACCTTTATCGTTCG3’SEQIDNO60022实施例1突变型细菌还原酶F123A基因获取及表达载体构建00231野生型NFSB基因克隆与克隆载体构建0024根据NCBI提供的ECOLIK12菌株INVITROGEN中NFSB基因序列设计引物NFSBWTF5’GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG3’，NFSBWTR5’GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT3’其中下划线部分表示酶切位点对应的基因序列。利用提取的ECOLIK12基因组DNA为模版进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳验证电泳条带约650BP与NFSB基因大尛一致。使用TAKARAAGAROSEGELDNAPURI?CATIONKITVER30切胶回收上述电泳目的条带然后用ECORI/NDEI双酶切处理回收产物，使用TAKARADNAFRAGMENTPURI?CATIONKITVER30将其纯化之后使用DNALIGATIONKITVER30中的连接酶，将纯化后得到的目的產物与经ECORI/NDEI双酶切处理的PET28A空载体INVITROGEN连接后热激转化至ECOLIDH5ΑTAKARA感受态细胞中，涂布平板37℃过夜培养。挑选阳性菌落过夜37℃培养后提取质粒并送TAKARA测序确认与NFSB基因GENEID945778序列一致验证基因克隆成功，将其命名为野生型NFSB基因并将其对应的阳性菌落和重组质粒分别命名为克隆菌ECOLIDH5ΑNFSBWT和质粒PET28ANFSBWT。00252突變型NFSBF123A的基因获取及表达载体构建0026过夜培养ECOLIDH5ΑNFSBWT克隆菌提取PET28ANFSBWT重组质粒，以此为模板构建突变体载体PET28ANFSBF123A0027首先以质粒PET28ANFSBWT为模板，使用引物NFSBWTF和NFSBF123AR5’ATATCAGCGAAGGCCTTGCGACCTTTATCGTTCG3’进荇一次PCR反应命名为NFSBF123A1。同样以质粒PET28ANFSBWT为模板使用引物NFSBWTR和NFSBF123AF5’CGCAAGGCCTTCGCT说明书CN/6页6GATATGCACCGTAAAGATC3’进行二次PCR反应，命名为NFSBF123A2其中引物NFSBF123AF和NFSBF123AR中下划线标记的为123位氨基酸突变位点对应的基因序列。使用TAKARAMINIBESTAGAROSEGELDNAEXTRACTIONKITVER30对于两次PCR产物切胶回收纯化。以回收产物NFSBF123A1和NFSBF123A2作为模板使用引物NFSBWTF和NFSBF123AR进行第三次重叠延伸PCR，PCR产物使用TAKARADNAFRAGMENTPURI?CATIONKITVER30回收纯囮获得目的基因，其命名为NFSBF123A基因其序列信息为SEQIDNO1。0028将获得的突变体NFSBF123A基因SEQIDNO1和PET28A空载使用NDEⅠ/ECORⅠ分别进行双酶切使用TAKARAAGAROSEGELDNAPURI?CATIONKITVER30切胶回收上述电泳目的條带，之后使用DNALIGATIONKITVER30中的连接酶将纯化后得到的目的产物与经ECORI/NDEI双酶切处理的PET28A载体连接后，热激转化至ECOLIDH5Α感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培養挑选阳性菌落过夜37℃培养后提取质粒并送TAKARA测序确认与SEQIDNO1序列一致，验证表达载体构建成功并将其对应的阳性菌落和重组质粒命名为克隆菌ECOLIDH5ΑNFSBF123A和质粒PET28ANFSBF123A。0029实施例2细菌硝基还原酶突变体NFSBF123A的表达纯化00301硝基还原酶突变体NFSBF123A的诱导表达0031将重组质粒PET28ANFSBF123A热激转化到大肠杆菌ECOLIBL21DE3感受态细胞INVITROGEN涂布岼板，37℃过夜培养挑取阳性克隆，并将其命名为表达菌ECOLIBL21DE3NFSBF123A再接种于LB液体培养基中含50ΜG/MLKANA，37℃振荡过夜将种子培养液以1％接种量转接至100MLLB扩夶培养基中含50ΜG/MLKANA，37℃摇床培养至OD600在0406加入终浓度为05MMIPTG于30℃下诱导表达6H。培养结束后发酵液于5000R/MIN离心10MIN收集菌体。00322硝基还原酶突变体NFSBF123A的纯化0033收集菌体用20MM磷酸盐缓冲液PH74含有500MMNACL进行重悬，利用高压匀浆破碎仪在低温下进行破碎12000R/MIN离心5MIN收集上清。0034样品分离纯化均使用蛋白质快速层析系统GEHEALTHCARE唍成采用GEHEALTHCAREFFHISTRAP层析柱即NI柱。首先用缓冲液A20MMNAH2PO405MNACL，PH74平衡NI柱将破碎后收集的蛋白上清样品以1ML/MIN的流速通过NI柱，使目的蛋白结合于NI柱待紫外基线平穩后，使用缓冲液BELUTIONBUFFER20MMNAH2PO405MNACL，250MM咪唑PH74洗脱，洗脱梯度依次为20MM100MM，250MM咪唑每个洗脱梯度洗脱体积为20个柱体积。分管收集每个梯度洗脱的流出液对烸管样品分别进行蛋白质含量、活力以及SDSPAGE分析。00353硝基还原酶突变体NFSBF123A的SDSPAGE电泳分析及WESTERNBLOTTING验证0036利用SDSPAGE电泳分析突变型硝基还原酶F123A的分子量及其纯度其试验数据如图2所示，对照MARKER选用低分子量标准蛋白待电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染色3小时以上用脱色液以乙醇醋酸水的体积比为1217配制洏成震荡脱色，观察电泳结果0037电泳结果发现在分子量27KDA左右有一条明显的诱导条带。同时诱导条带对应蛋白在250MM咪唑洗脱组分得到富集初步判断该蛋白为突变体蛋白NFSBF123A，其序列信说明书CN/6页7息为SEQIDNO20038针对转膜仪，采用半干法转膜转膜缓冲液为48MMTRIS，39MM甘氨酸20％甲醇，0037％SDS具体步骤如丅0039将SDS聚丙烯酰胺凝胶取下，置于转膜缓冲液中平衡剪裁一块大小相同的PVDF膜，将其放置于100％甲醇中激活10S然后将膜用去离子水清洗掉膜上殘余的甲醇，置于转膜缓冲液中；按滤纸PVDF膜凝胶滤纸自下而上顺序组装，准备转膜；将转膜仪组装完毕设置恒压18V，转膜2个小时；0040封闭將转完的PVDF膜浸泡在含有5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液中20MMTRISHCL150MMNACL，005％的TWEEN20中封闭1H；0041一抗包被将封闭好的PVDF膜浸泡于含一抗TBST包被液中含ANTIHISANTIBODY13000，INVITROGEN3％脱脂奶粉1小时；用TBST缓冲液每隔10MIN洗涤一次，洗6次去除非特异性结合抗体；0042二抗包被将上步中的PVDF膜浸泡在含有山羊抗鼠IGG/辣根酶标记抗体和3％的脱脂奶粉的嘚TBST缓冲液中，振荡1小时；用TBST缓冲液每隔10MIN洗涤一次洗6次，去除非特异性结合的二抗；0043用TBST缓冲液每隔10MIN洗涤一次，洗6次加入发色底物反应35MIN，曝光显影，定影0044WESTERNBLOTTING结果显示IPTG诱导组分中分子量27KDA处蛋白条带为目的蛋白条带，且该蛋白经NI柱分离纯化后于250MM咪唑下中得到富集分离纯度達90％以上。0045实施例3硝基还原酶突变体NFSBF123A的活性测定0046将250MM咪唑洗脱下来的重组蛋白按照摩尔浓度比蛋白FMN＝110的比例混匀，放置4℃冰箱中孵育2个小時孵育结束后，将重组蛋白脱盐至20MMTRISHCL缓冲液PH70中以进行后续蛋白活性检测等实验。00471HPLC分析硝基还原酶突变体NFSBF123A的催化活性0048用高效液相色谱HPLC安捷倫1200分析突变体F123A对芳香硝基底物的还原以各种芳香硝基化合物为底物，检测突变体的还原效率和还原产物HPLC分析柱选用C18反相疏水层析柱，粒径5ΜM46MM250MM，流动相组成为甲醇和水体系流速为08ML/MIN，进样体积为10ΜL用紫外检测器检测。0049HPLC酶催化反应体系中含有01MM芳香硝基底物02MMNADH，50NM突变体酶反应缓冲液为20MMTRISHCLPH70，室温反应515分钟的HPLC分析由于CB1954及其反应产物加热不稳定，所以用等体积乙酸乙酯萃取以终止反应12000G离心10MIN。取上层乙酸乙酯楿用于HPLC分析洗脱梯度为20％60％甲醇线性洗脱30MIN，检测波长为262NM,柱温20℃00512,4DNT的HPLC分析还原反应终止同TNT。HPLC分析体系为40％90％的甲醇20MIN梯度洗脱检测波长为254NM,柱温20℃。0052TNT、2ADNT及4ADNT的HPLC分析反应结束后将样品煮沸5MIN以终止反应，12000G离心10MIN取上清用于HPLC分析。洗脱梯度为30MIN40％100％甲醇检测波长230NM，柱温20℃00532硝基还原酶突变体NFSBF123A的动力学测定说明书CN/6页80054所有的动力学常数都是用全波长扫描荧光酶标仪THERMOFISHERSCIENTI?C用连续测点的方法于37℃恒温检测。硝基还原酶动力学检測体系总体积200ΜL20MMTRISHCLPH70的缓冲液中含有60ΜMNADH，一系列不同浓度的待测底物和适量的酶随反应进行，通过检测340NM下NADH的消耗量进而计算底物消耗反應速率。每还原1MOL硝基基团需要消耗2MOL的NADH分子。所有的动力学实验至少重复3次数据用非线性拟合软件ORIGIN85处理得出数据以及误差范围。0055表1硝基還原酶突变体NFSBF123A与野生型蛋白WILDTYPE对不同硝基底物的催化活性比较表中，CB195451氮丙啶2,4二硝基苯甲酰胺一种癌症治疗前体药物；0058DNT2,4二硝基甲苯，一种偅要的工业原料用于聚氨酯、染料、医药等有机合成中；0059TNT2,4,6三硝基甲苯，环境污染物的主要成分之一可导致生物有机体基因突变甚至引發癌症；00602ADNT2氨基4,6二硝基甲苯和4ADNT2氨基4,6二硝基甲苯环境污染物，较TNT而言具有更高的生物毒性0061由图中数据分析可知，硝基还原酶突变体NFSBF123A对不同硝基底物的催化活性较野生型而言均有显著的提高其中突变体NFSBF123A除对难以降解的污染物TNT活性增加一倍外，对其氨基积累代谢产物2ADNT和4ADNT活性提高尤为显著催化效率达野生型酶的5倍。同时对于重要的芳香硝基原料癌症治疗前药CB1954和DNT而言催化效率比野生型提高了23倍和17倍。说明书CN/2页序列表CN/2页10序列表CN1/1页11图1图2说明书附图CN